交替共聚物纳米花的自组装及在单颗粒表面增强拉曼散射检测中的应用

纳米花(NFs)是一种花状的纳米颗粒，具有多级的结构和较大的比表面积，在催化、吸附、分析科学、生物传感、药物递送等领域展现出了广泛的应用，因此引起了广泛关注[1~6]. 迄今为止，纳米花主要由无机化合物合成，包括金属单质、金属氧化物和金属硫化物等[7~9]. 然而，由于高的比表面积，无机纳米花很容易发生团聚，这极大地限制了它们的应用. 通常，需要引入稳定剂或配体来改善无机纳米花的分散[10,11].

与无机纳米花相比，有机聚合物纳米花具有稳定性好、分散性好以及功能化容易的特点. 然而，据我们所知，可以用来制备纳米花的聚合物是非常有限的，目前主要包括聚苯胺[12]、硼酸酯聚合物[13]、聚酰亚胺(PI)[1,2]和纤维素硬脂酸酯(CSE)[14]等. 与无机化合物相比，聚合物的结晶度较低，因此只有具有高的链规整性的聚合物才可以自组装为纳米花. 例如只有酰亚胺化程度大于92%的聚酰亚胺(PI)才可以形成纳米花，否则只能获得非晶组装体[1]. 只有硬脂酸酯取代率高于99%的纤维素(CSE)才可以形成纳米花，否则只能得到表面粗糙的颗粒[14]. 此外，实现聚合物纳米花的粒径控制和大规模制备也是非常有挑战性的.

聚合物自组装是一种制备各种各样的纳米材料和功能材料的非常实用的策略[15~21]. 与其他类型的聚合物结构相比，交替共聚物是一类结构精确的聚合物，最近它已被证明是一种非常有潜力的聚合物自组装基元. 目前，已经通过交替共聚物自组装得到了纳米管[22]、囊泡[23~25]、纳米球[26]、结晶性纳米棒[27]、空心聚合物球[28]、海胆状组装体[29]、螺旋桨状组装体[30]和细胞骨架状组装体[31]等结构[32,33].

在本文中，我们通过点击聚合合成了结晶性的交替共聚物P(DHB-a-DDT)，这种聚合物可以通过在溶液中降温的方法自组装为纳米花(图1). 通过控制聚合物浓度，纳米花的尺寸可以在3.3~12.6 μm的范围内调节. 进一步地，利用聚合物纳米花上的硫与银离子配位然后原位还原，可以很容易地制备负载Ag颗粒的纳米花(AgNP-NFs). 银含量只有11.9 wt%的AgNP-NFs表现出优异的表面增强拉曼散射性能，其检测限为1×10-8 mol/L. 与从AgNP-NFs上剥离的Ag颗粒相比，AgNP-NFs的SERS检测限要低2个数量级，这是Ag颗粒和纳米花协同作用的结果. 同时，由于AgNP-NFs具有良好的分散性和多孔结构，微米级的AgNP-NFs可以实现单颗粒SERS检测，这极大地降低了检测成本. 据我们所知，在如此低的Ag含量下，高灵敏度的单颗粒SERS检测是很难实现的[34~36]. 因此，本文的研究不仅扩展了交替共聚物的自组装行为，而且丰富了聚合物纳米花的类型和功能.

Fig. 1  Schematic diagram of the preparation process of NFs and AgNP-NFs as well as their surface-enhanced Raman scattering (SERS) detection.

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1 实验部分

1.1 实验试剂

二环氧化-1,3-丁二烯(TCI)、1,5-己二烯二环氧化物(TCI)、1,10-癸二硫醇(TCI)、1,8-辛二硫醇(Adamas)、1,6-己二硫醇(Adamas)、1,4-丁二硫醇(TCI)、乙酸酐(国药-沪试)、4-二甲氨基吡啶(Adamas)、三乙胺(Adamas)，三氯甲烷(Greagent)、甲醇(Greagent)、正己烷(Greagent)，N,N-二甲基甲酰胺(Greagent)、硝酸银(Greagent)、罗丹明6G (Adamas)，以及抗坏血酸钠(Adamas)均直接使用.

1.2 仪器与表征

1.2.1 核磁氢谱(1H-NMR)和碳谱(13C-NMR)

1H-NMR和13C-NMR在Bruker AVANCE III HD 400或Bruker AVANCE III HD 500核磁共振波谱仪上测试. P(DHB-a-DDT)使用DMSO-d6为溶剂，P(DHH-a-DDT)和酯化封端后的交替共聚物使用CDCl3为溶剂，测试温度为25 ℃，使用TMS为内标.

1.2.2 凝胶渗透色谱(GPC)

GPC在LC-20A凝胶渗透色谱仪上测试. 流动相为THF，标样为PS. 凝胶柱为KF-802和804(Shodex, 300×8 mm)，流速为1.0 mL/min，进样量为50 μL，测试温度为40 ℃.

1.2.3 光学显微镜

光学显微镜图片在DM-4500B光学显微镜上拍取.

1.2.4 扫描电子显微镜

扫描电镜图片(SEM)在场发射扫描电子显微镜(Nova NanoSEM 450)上拍取. 加速电压为10 kV.

1.2.5 示差扫描量热仪(DSC)

DSC曲线在Q2000调制型示差扫描量热仪上测试. 升降温速率为10 ℃/min. 温度扫描范围为-80~180 ℃.

1.2.6 X射线衍射谱(XRD)

XRD在Mini Flex 600 X射线衍射仪上测试. 电压为40 kV，电流15 mA. X射线光管：Cu靶(λ = 0.154 nm). 2θ扫描范围为3º~60º，扫描速度为6 (º)/min.

1.2.7 紫外-可见(UV-Vis)吸收光谱

UV-Vis吸收光谱在Perkin Elmer Lambda 20紫外可见分光光度计上测试，波长范围为200~800 nm.

1.2.8 紫外-可见漫反射光谱(UV-Vis DRS)

UV-Vis DRS在Lamda 950紫外可见近红外分光光度计上测试.

1.2.9 氮气等温吸脱附曲线

氮气等温吸脱附曲线在ASAP 2460全自动比表面与孔隙度分析仪上测试. 样品在测试前，先在30 ℃下真空脱气12 h. 通过NLDFT方法计算孔径分布曲线.

1.2.10 电感耦合等离子光谱(ICP)

ICP在Avio 500电感耦合等离子体发射光谱仪上测试.

1.2.11 拉曼光谱

拉曼光谱在Renishaw inVia Qontor共焦显微拉曼光谱仪上测试. 激光器波长为532 nm，激光功率为0.032 mW，曝光时间为1 s，采集次数为1次，使用50倍的长焦物镜进行样品观察(L 50×/0.50). 制样过程如下：将0.9 mL 1 mg/mL的AgNP-NPs的水溶液与0.1 mL不同浓度的R6G的水溶液(10-5、10-6、10-7、10-8和10-9 mol/L)混合. 12 h后，将混合溶液过滤，得到吸附R6G的Ag-NPs，然后进行拉曼光谱采集.

单颗粒SERS检测的测试条件与上述相同，制样过程如下：首先，取不同浓度的AgNP-NFs的水溶液(1、0.1、0.01和0.001 mg/mL) 50 μL滴在硅片上(1 cm × 1 cm)干燥作为SERS基底. 然后，取50 μL R6G溶液(1×10-8 mol/L)滴在上述SERS基底上，确保与AgNP-NFs溶液的滴加区域重叠. 溶液干燥后，用共焦显微拉曼光谱仪上配备的显微镜找到单个AgNP-NFs颗粒后进行拉曼光谱采集.

1.3 实验过程

1.3.1 交替共聚物P(DHB-a-DDT)的合成

P(DHB-a-DDT)的合成是通过巯基和环氧的点击聚合合成的. 合成路线如电子支持信息示意图S1所示，合成过程如下：1,10-癸二硫醇(0.03 mol)，二环氧化-1,3-丁二烯(0.03 mol)和三乙胺(0.06 mol)用3 mL甲醇和10 mL DMF溶解，首先在室温下搅拌2 h，然后在60 ℃下继续反应26 h. 反应结束后，产物在乙醇中沉淀，收集沉淀并在60 ℃下真空干燥，得最终产物.

1.3.2 交替共聚物P(DHB-a-DDT)的酯化封端

P(DHB-a-DDT)的酯化封端如电子支持信息示意图S2所示，合成过程如下：P(DHB-a-DDT) (0.86 mmol重复单元)，乙酸酐(17.2 mmol)和4-二甲氨基吡啶(10 mg)分散在6 mL氯仿中，然后在耐压瓶中70 ℃反应27 h. 反应结束后，将溶剂旋干，用少量氯仿溶解后在正己烷中沉淀3次. 将得到的沉淀在60 ℃下真空干燥后，收集产物.

1.3.3 纳米花的自组装

纳米花的自组装过程如下：在80 ℃下将2 mL P(DHB-a-DDT)的DMF溶液(1 mg/mL)与2 mL乙腈混合，然后在80 ℃烘箱中自然冷却至室温(22 ℃). 72 h后，用乙腈离心洗涤3次，得到组装体.

1.3.4 负载银颗粒的纳米花(AgNP-NFs)的制备

负载银颗粒的纳米花的制备过程分为两步. 第一步，将得到的纳米花(100 mg，0.342 mmol重复单元)在40 mL水中分散，加入0.5 mol/L硝酸银溶液1.368 mL (0.684 mmol AgNO3)，反应48 h. 离心洗涤3次后，得到银离子配位的纳米花. 第二步，将得到的银离子配位的纳米花用40 mL去离子水重新分散，加入抗坏血酸钠溶液(203 mg抗坏血酸钠用20 mL去离子水溶解)，反应12 h. 离心洗涤3次后，得到负载银颗粒的纳米花.

2 结果与讨论

2.1 交替共聚物的结构表征

如图1所示，交替共聚物P(DHB-a-DDT)是通过1,10-癸二硫醇和二环氧化-1,3-丁二烯之间的巯基-环氧点击聚合合成的. 合成和表征细节如电子支持信息示意图S1~S2和图S1~S4所示. 如电子支持信息图S1的1H-NMR所示，聚合物上的质子信号(峰a~h)可以得到很好的归属. 其中，峰e与峰b的积分面积比为2:1，表明2种结构单元是等摩尔比的，这与交替共聚物的结构特征是完全吻合的. 在13C-NMR中(电子支持信息图S2)，7个峰(峰1~7)正好对应聚合物上的7种碳. 为了表征聚合物的分子量，对聚合物上的羟基进行酯化封端(电子支持信息示意图S2和S3). 如电子支持信息图S4的GPC曲线和表S1所示，聚合物的数均分子量为2.07×104，Mw/Mn为1.73. 聚合物的结晶性通过XRD进行表征. 如电子支持信息图S5所示，聚合物在2θ=5.64° (d = 1.57 nm)和19.96° (d = 0.44 nm)处有2个尖锐的衍射峰，其中1.57 nm对应于层状相的层间距，0.44 nm对应于烷基链结晶的横向距离[14,37,38]. 这表明聚合物具有很好的结晶性.

2.2 纳米花的自组装

纳米花的自组装是通过在混合溶剂(DMF/MeCN=1/1, V/V)中降温的方法实现的. 其中DMF是交替共聚物P(DHB-a-DDT)的良溶剂，MeCN是沉淀剂. 当从80 ℃冷却至室温后，溶液底部会有大量白色沉淀产生. 组装体的形貌通过光学显微镜(OM)和扫描电子显微镜(SEM)进行表征. 如图2(a)的OM图像所示，颗粒的表面是粗糙的，这与纳米花的形貌特征是一致的. 而且，在偏光显微镜(POM)图像中(图2(a)，右)，纳米花表现出明显的双折射现象，说明纳米花具有良好的结晶性. 通过XRD进一步表征了纳米花的结晶性(电子支持信息图S5)，纳米花的结晶性是优于未组装的初始聚合物粉末的. SEM图像(图2(b)~2(c)和电子支持信息S6)清楚地表明了纳米花的结构. 可以发现，纳米花是由厚度约为90 nm的纳米片堆积而成的(图2(c)). 由于自组装的产率高于80%，因此可以大规模制备纳米花(图2(b)插图)，每次可以得到克级的组装体. 有趣的是，通过控制聚合物的浓度，纳米花的直径可以在3.3~12.6 μm范围内调节(图2(d))，这为定制具有特定尺寸的纳米花提供了可能性. 为了观察纳米花的内部结构，将纳米花在液氮中研磨以暴露其内部结构. 代表性的SEM图像如图2(e)和2(f)所示，可以发现纳米花的内部也由弯曲的纳米片组成的，而不是实心或空心结构.

Fig. 2  Morphology of NFs. (a) OM image (left) and corresponding POM image (right). (b) Low-magnification SEM image (Inset: photograph of NFs). (c) High-magnification SEM image of NFs (Inset: enlarged image of a single NF). (d) Variation of diameter of NFs as a function of polymer concentration in DMF. (e, f) SEM images of the internal structure of NFs obtained by grinding in liquid nitrogen.

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2.3 纳米花的自组装机理

纳米花的自组装机理是通过捕获自组装过程中的中间体来研究的(电子支持信息图S7). 在不同时刻获得的中间体如图3(a)~3(f)所示. 最初，P(DHB-a-DDT)在80 ℃的混合溶剂中是溶解的. 随着温度降低，聚合物在混合溶剂中的溶解度降低，聚合物逐渐聚集形成晶核(图3(a)). 随着时间的延长，聚合物沿着核生长，形成弯曲的纳米片(图3(b)). 进一步延长自组装时间，弯曲的纳米片彼此聚集形成初级纳米花，并且初级纳米花的尺寸随着时间延长而逐渐增大(图3(c)~3(e))，最后得到最终的纳米花(图3(f)). 图3(g)总结了这一四步的自组装过程. 由于纳米花是由纳米花堆积而成的，所以纳米花具有多孔结构. 纳米花的Brunauer-Emmett-Teller (BET)比表面积为11.09 m2/g，孔径主要分布在2~50 nm之间(电子支持信息图S8).

Fig. 3  Formation mechanism of NFs. (a‒f) SEM images of intermediates in the self-assembly of NFs as a function of growth time. (g) Schematic diagram of the proposed formation mechanism of NFs.

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2.4 纳米花的可控制备

纳米花的自组装可以通过聚合物浓度、DMF/MeCN的体积比和沉淀剂的类型等因素控制. 首先，可以通过控制聚合物浓度来调节纳米花的大小(图2(d)和电子支持信息图S9~S10). 随着聚合物浓度从0.2 mg/mL增加到10 mg/mL，纳米花的直径从3.3 μm增加到12.6 μm. 其次，颗粒的形貌依赖于DMF/MeCN的体积比(电子支持信息图S11). P(DHB-a-DDT)可以在DMF/MeCN为2/1和2/2时自组装成纳米花，如果使用更多的MeCN (DMF/MeCN≤2/3)，则得到纳米花和微球的混合物. 过多MeCN的加入降低了聚合物在80 ℃的初始混合溶剂中的溶解度，导致微球的形成. 最后，除MeCN外，还可以使用沉淀剂如丙酮和乙酸乙酯获得纳米花(电子支持信息图S12)，但是其他的沉淀剂如二氧六环、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、叔丁醇、甲苯、氯仿和四氢呋喃是不能得到纳米花的.

纳米花的自组装也与聚合物组成有关. 如电子支持信息图S13~S15所示，将二硫醇单体从1,10-癸烷二硫醇(DDT)变为1,8-辛烷二硫醇(ODT)和1,6-己二硫醇(HDT)，仍然可以得到纳米花. 然而，如果使用1,4-丁二硫醇(BDT)作为二硫醇单体，则相应的聚合物不能自组装为纳米花，这可能是由于该聚合物的结晶性差的原因(电子支持信息图S14). 此外，将二环氧单体从1,3-丁二烯二环氧化物(BDE)变为1,5-己二烯二环氧化物(HDE)后，相应的聚合物是不能自组装为纳米花的，只能得到含有微球的不规则聚集体(电子支持信息图S15(c)). 值得注意的是，交替共聚物的分子量对纳米花的组装是基本没有影响的，如图电子支持信息图S16所示，3种不同分子量的交替共聚物都可以自组装为纳米花，而且纳米花的粒径基本一致，都在7~8 μm之间. 这一点和我们前期的理论预测一致，交替共聚物自组装在分子量超过阈值后，其自组装行为和分子量及分子量分布基本无关[39].

2.5 纳米花的功能化

考虑到交替共聚物上有许多活性位点，如硫原子和羟基，纳米花可以很容易地进行功能化. 例如可以通过聚合物上的硫原子与银离子的配位来获得银离子配位的纳米花[40,41]. 然后，在抗坏血酸钠的还原下，原位形成负载Ag纳米颗粒的纳米花(AgNP-NFs). 如电子支持信息图S17的插图所示，负载Ag颗粒(AgNP)后，纳米花的颜色从白色变为深灰色，这与UV-Vis漫反射光谱是一致的(电子支持信息图S17). SEM图像显示，AgNP-NFs保持了花状形貌(图4(a))，并且在AgNP-NFs的表面和空腔中有很多小的银颗粒(AgNPs). 在放大的图像上(图4(b))，可以更清楚地观察到AgNPs的形貌. 通过对200个颗粒进行统计分析(电子支持信息图S18)，AgNPs的平均直径为(88.4±34.5) nm. 此外，通过XRD图谱确认了AgNP-NFs的组成. Ag的特征衍射峰(111)和(200)可以在2θ=38.16°和44.36°处发现，表明AgNP-NFs中形成了Ag纳米晶体(电子支持信息图S19). 进一步地，通过电感耦合等离子体发射光谱(ICP-OES)测定AgNP-NFs中的Ag含量为11.9 wt%. 此外，AgNP-NFs具有一定的吸附能力，这得益于其多孔结构. 如电子支持信息图S20和S21所示，将AgNP-NFs与罗丹明6G (R6G)混合12 h后，溶液中R6G的浓度从最初的0.51 mg/L降至0.20 mg/L.

Fig. 4  Morphology and SERS detection of AgNP-NFs. (a) Low-magnification SEM image and (b) high-magnification SEM image of AgNP-NFs. (c) Raman signals of R6G at different concentrations (1×10-6‒1×10-10 mol/L) using AgNP-NFs as SERS substrates. (d) Raman signals of R6G (1×10-8 mol/L) recorded from a single particle with different concentrations of AgNP-NFs (inset: OM image of a single AgNP-NF taken by optical microscope equipped on the Raman spectrophotometer, scale bar=20 μm).

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2.6 负载银颗粒的纳米花在SERS检测中的应用

贵金属纳米颗粒，如Au和Ag，由于其表面等离子体共振(LSPR)效应，是表面增强拉曼散射(SERS)最常用的基底材料[11,42,43]. AgNP-NFs用作SERS基底，具有以下优点. 首先，AgNP-NFs的纳米花状结构增加了激光在AgNP-NFs内的反射，增强了入射激光与基底之间的相互作用. 其次，AgNP-NFs具有多孔结构和一定的吸附能力，可以富集目标分子，从而可以在低浓度下检测到拉曼信号. 第三，AgNP-NFs上负载的AgNPs的尺寸为(88.4±34.5) nm，这一尺寸是适合用于SERS检测的[44].

使用R6G作为探针分子对AgNP-NFs的SERS性能进行研究. 不同浓度的探针分子(1×10-6~1×10-10 mol/L)与AgNP-NFs混合12 h后，过滤出来进行拉曼检测. 明显地，拉曼信号强度强烈依赖于R6G浓度，随着R6G浓度的降低而逐渐减弱(图4(c)). 即使在1×10-8 mol/L的低浓度下，R6G的特征拉曼信号可以很好地分辨(图4(c)和电子支持信息表S2). 然而，当进一步降低探针分子浓度时，拉曼信号是无法被检测到的，这意味着AgNP-NFs的检测限为1×10-8 mol/L. 为了更好地证明AgNP-NFs在SERS检测中的优势，我们进行了两个对比实验. 首先，将AgNP-NFs上的AgNPs剥离作为对照实验(电子支持信息图S22~S25). 值得注意的是，如图S24的AFM所示，AgNPs的表面是粗糙的，这有利于SERS检测，因为粗糙的表面可以产生强电磁场以放大目标分子的拉曼散射信号[45,46]. 剥离的AgNPs的SERS检测限只能达到1×10-6 mol/L (电子支持信息图S25)，比AgNP-NFs高2个数量级. 另一个对比实验是使用负载AgNPs的聚合物膜作为SERS基底(电子支持信息图S26(a)和26(b)). 可以发现，在相同的R6G浓度下，AgNP-NFs的拉曼信号强度是负载AgNPs的聚合物膜的3倍以上(图S26(c)). 也就是说，AgNP-NFs优异的SERS性能既与AgNPs有关也与纳米花的结构有关.

2.7 负载银颗粒的纳米花的单颗粒SERS检测

AgNP-NFs由于其微米级的尺寸、良好的分散性和多孔结构，可以用于单颗粒SERS检测. 随着AgNP-NFs含量(1、0.1、0.01至0.001 mg/mL)的降低，R6G (1×10-8 mol/L)的拉曼信号强度基本保持不变(图4(d)). 也就是说，在极低的AgNP-NFs浓度(0.001 mg/mL)以上时，拉曼信号不受AgNP-NFs浓度的影响. 同时，AgNP-NFs在单颗粒SERS检测中表现出良好的信号重现性，在0.001 mg/mL的AgNP-NFs浓度下，10个粒子的信号几乎相同(电子支持信息图S27). AgNP-NFs的单颗粒SERS性能超过了许多其他已报道的材料，尤其是在11.9 wt%的低Ag含量下(电子支持信息表S3). 也就是说，AgNP-NFs可以在非常低的材料消耗下实现痕量检测的目的，这有望极大地降低检测成本.

3 结论

本文通过硫醇和环氧的点击聚合合成了交替共聚物P(DHB-a-DDT)，它可以通过在混合溶剂中降温的方法，大量制备微米尺寸的纳米花. 组装机理研究表明，纳米花由纳米片堆积而成. 通过改变聚合物浓度，可以实现纳米花粒径的调节(3.3~12.6 μm). 进一步地，利用聚合物上硫原子和Ag离子之间的配位作用然后原位还原，制备了负载银颗粒的纳米花，其中Ag含量为11.9 wt%. 具有低Ag含量的AgNP-NFs显示出优异的SERS性能，其检测限为1×10-8 mol/L. 与从AgNP-NFs上剥离的AgNPs相比，AgNP-NFs的SERS检测限比AgNPs低2个数量级，这是AgNPs和纳米花状结构协同作用的结果. 同时，AgNP-NFs可用于单颗粒SERS检测，既保证了高的灵敏度又极大地降低了检测成本. 这项工作证明了使用交替共聚物制备纳米花的可行性，扩展了交替共聚物的自组装行为，丰富了聚合物纳米花的类型和功能.