E.coliDH10B碱性磷酸酶基因的克隆、表达及活性研究-医学论文

碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，AKP）是一类非特异性磷酸单酯酶，可催化磷酸单酯的水解[1]。AKP广泛存在于多种细菌、真菌和动物中。不同来源的AKP的相对分子质量和编码序列差异很大，且各种AKP的性质、结构、功能和催化机制也不完全相同。其中，E.coliAKP由phoA基因编码，为同源二聚体金属酶，单体由449个氨基酸组成，相对分子质量为47K，活性中心包括3个金属原子，即2个锌原子和1个镁原子[2]。

　　E.coliAKP催化机制明确，底物范围广泛，作为工具酶在表位连锁、组织化学、免疫印迹、突变分析等方面有广泛应用。E.coliDH10B无致病性和耐药基因，是基因克隆的常用受体菌。本研究首次从E.coliDH10B基因组中克隆了AKP的成熟肽基因（phoAm）并进行了表达研究，从而为此种酶的结构、功能和应用研究打下了坚实的基础。

　　1材料与方法

　　1.1材料

　　1.1.1菌株、载体大肠杆菌菌株E.coliDH10B、E.coliBL21（DE3）、E.coliDH5α及原核表达载体pET28a（+）由热带生物资源教育部重点实验室保存。

　　1.1.2试剂T4DNA连接酶、限制性核酸内切酶BamHⅠ、HindⅢ、氨苄青霉素、卡那霉素、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）、对硝基苯磷酸（pNPP）购自生工生物（上海）有限公司。质粒提取试剂盒、DNA产物纯化试剂盒、PfuDNA聚合酶购自天根生化科技（北京）有限公司。His标签蛋白纯化试剂盒、重组标签蛋白快速检测试剂盒GoldCassette-HIS购自北京康为世纪生物科技有限公司。

　　1.1.3引物引物设计后由生工生物（上海）有限公司合成。

　　1.1.4仪器UV-2450紫外可见分光光度计（岛津）；超微量黑色石英比色皿（岛津）；PCR扩增仪（2720ThermalCyclerAppliedBiosystems）；凝胶成像系统（BioRad）。

　　1.2方法

　　1.2.1E.coliDH10B基因组DNA的提取与纯化E.coliDH10B甘油菌经LB培养液增菌培养后，用天根公司的细菌基因组DNA提取试剂盒进行提取与纯化。提取的基因组DNA用紫外分光光度法进行评价。

　　1.2.2引物设计从Genbank数据库下载E.coliDH10B的phoA基因序列（accessionnumber：NC-010473），使用PrimerPremier6.0和Oligo7.37辅助设计用于扩增AKPphoAm的引物，为便于克隆进表达载体pET28a中，在引物两端加上适当的酶切位点和保护碱基。设计的引物如下，正向引物（phoAm-F）：5'-GTCATGGATCCCGGACACCAGAAATGCC-3'（BamHⅠ）；反向引物（phoAm-R）：5'-GCGACAAGCTTTATTTCAGCCCCAGAGC-3'（HindⅢ）。

　　1.2.3PCR法扩增phoA基因在0.2mlPCR管内配制50μl反应体系，按下述程序进行PCR扩增：94℃预变性3min；扩增30个循环，即94℃30s→55℃30s→72℃2min；72℃延伸5min。反应结束后，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测并进行测序。

　　1.2.4phoAm基因的克隆PCR产物经DNA产物纯化试剂盒纯化后，用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ双酶切，并与同样经BamHⅠ和HindⅢ双酶切的表达载体pET28a（+）经T4DNA连接酶连接后，转化E.coliBL21（DE3）感受态细胞，经LB/kan筛选平板培养后，用菌落PCR鉴定转化子。

1.2.5phoAm基因的诱导表达分别接种pET28a-phoAm/BL21（DE3）和pET28a/BL21（DE3）单菌落至5mlLB培养液中，37℃振荡培养过夜。按1%的比例接种阳性菌液至100mlLB培养液中，37℃振荡培养，至菌液OD600nm约为0.4时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导，继续培养3h。

　　1.2.6重组蛋白（rAKP）的检测菌体离心后，加入缓冲液超声破碎，离心取上清液，用免疫金层析法检测6×His标签，用SDS-PAGE法检测表达蛋白。

　　1.2.7重组蛋白（rAKP）的纯化采用Ni-AgaroseHis标签蛋白纯化试剂盒进行纯化。对洗脱液进行SDS-PAGE分析并用Bradford法定量。

　　1.2.8重组蛋白（rAKP）的活性分析采用对硝基酚磷酸（pNPP）法测定rAKP的活性。取发酵菌体超声破碎后的上清液，加入测活液，30℃反应10min，加入终止液终止反应，于波长410nm处测吸收值。

　　2结果

　　2.1PCR扩增E.coliDH10B成熟肽基因（phoA）

　　PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上分析，可见1.4kb的条带（图1）大小与预期一致。

　　1.DNAMarker；2.PCR产物

　　图1E.coliDH10BphoAmPCR产物的琼脂糖凝胶电泳

　　2.2重组蛋白（rAKP）的表达与检测

　　重组菌诱导表达后，取超声破碎后的上清液，分别用免疫金层析法快速检测6×His标签（图2），用SDS-PAGE法检测表达蛋白（图3）。rAKP的分子量约为47K。

　　1：阴性对照；2：rAKP（含6×His标签）

　　图2免疫金层析法快速检测His标签蛋白

　　从左至右分别为诱导0、2、4h；第4泳道为蛋白质分子量Marker

　　图3SDS-PAGE检测诱导表达的rAKP

　　2.3重组蛋白（rAKP）的活性分析

　　rAKP经活性分析，对照菌E.coliBL21（DE3）的OD405nm为0.120，重组菌E.coliBL21（DE3）/phoAm的OD405nm为2.58，即重组菌的碱性磷酸酶活性提高21.5倍。

　　3讨论

　　本研究首次从E.coliDH10B菌株的基因组中克隆了碱性磷酸酶成熟肽基因，并进行了表达、纯化与活性研究。E.coliAKP作为工具酶在表位连锁、组织化学、免疫印迹、突变分析等方面有广泛应用。目前市场上常见的AKP产品有虾碱性磷酸酶（SAP）和牛小肠碱性磷酸酶（CIAP），其中CIAP的活性最高，约为天然E.coliAKP的40倍[3]。与天然提纯的SAP和CIAP相比，E.coliAKP的生产成本低，热稳定性好。由于AKP的构效关系明确，且在定点诱变和结构改造方面积累了一定的经验[4-5]。进一步研究可结合计算机模拟对E.coliAKP的三维结构与催化活性之间的关系进行深入分析[6]，利用当前蛋白质工程的先进技术手段对重组E.coliAKP进一步改构。