摇床T25细胞培养瓶流体力学与传质特性研究

引 言

动物细胞培养是生物技术的一个重要分支，是现代生物医药的支柱。现有的治疗性生物制品超过50%在动物细胞中产生。2018年，基于动物细胞培养的诊疗产品产值约为2372亿美元，预计2024年增长至3890亿美元[1]。随着细胞培养工艺的日渐成熟，近年来又有新的应用领域被开发出来，如细胞培养肉技术[2]。在这种背景下，越来越多的研究人员开始关注动物细胞培养相关研究。

实验室规模的动物细胞培养常在孔板、方瓶和转瓶中进行[3]。其中孔板和方瓶主要用于静置培养，转瓶主要用于悬浮培养。相对于静置培养，悬浮培养可以达到更高的细胞密度，尤其是对于贴壁依赖型细胞，如常用的模式细胞HEK293[4]，某些CHO细胞系，以及牛[5]或者猪肌肉干细胞[6]等。这些细胞在孔板或方瓶中单层贴壁培养仅能达到104~105 cells/cm2，而悬浮培养则可以达到106~107 cells/ml或更高。在细胞培养放大过程中，方瓶还常常作为中间步骤用于转瓶或小型搅拌釜反应器之前[4]。Zhang等[7]通过分析得出，实验室常用的Thermo Fisher Scientific T25培养瓶的传质系数比250 ml转瓶高10倍左右，理论上可以支持更高的细胞浓度。如果可以在方瓶中进行悬浮培养，尤其是加有微载体的悬浮培养，进而达到更高的密度，对简化细胞培养工艺、减少放大步骤将有很大的帮助。此外，得益于方瓶的微小体积（T25方瓶最大装液量不超过10 ml），还可以实现高通量筛选，避免静置培养时由于混合、传质、剪切等条件与大型反应器不同，筛选到不适合大规模生产的细胞系或者培养基[8]。

Fujii等[9]研究了使用超声波使细胞在T25培养瓶中悬浮的技术，发现在超声波的作用下悬浮的CHO细胞增殖1000倍的时间比静置培养缩短了14%。然而这种做法需要特殊的超声波发生器，较难推广。事实上，只要将方瓶置于翘板摇床（或称“摆床”）之上，就有可能实现悬浮培养，其机理类似于思拓凡(Cytiva，原GE Healthcare)的波浪式（WAVE®）反应器。此类反应器出现在20世纪90年代，是最早的一次性生物反应器，如今已广泛应用于从实验室到中试规模的细胞培养[10-12]。Zhan等[13]通过计算流体力学(CFD)模拟研究了WAVE反应器内的流体力学特性，并发现了特定摆动频率下由于共振现象使混合和传质变差的现象。然而，由于方瓶特征尺寸较小，湍流程度较低，其操作条件与常规的台式波浪反应器之间不能简单换算，因此有必要针对T25培养瓶进行进一步研究。

本文将传统上一般用于静置培养的T25方形培养瓶置于翘板摇床上，对其传质及混合特性进行了系统性研究，并借助CFD模型对不同操作条件下的能量耗散和剪切情况进行了分析。报道了不同振荡频率下T25方瓶的传质系数、混合时间等基础数据，为使用该装置进行高密度细胞悬浮培养提供数据支持和理论参考。这将有利于推动基于T25方瓶的一次性微型反应器开发，实现高通量筛选，促进生物医药产业的发展。

1 实验材料和方法

1.1 实验材料

T25细胞培养瓶，购自Thermo Fisher Scientific公司，材质为聚苯乙烯，底面积为25 cm2，工作体积7 ml。实验中所需的磷酸二氢钾（99%）、氯化钠（99.8%）、二水合磷酸二氢钠（99%）和十二水合磷酸氢二钠（99%），购自国药集团化学试剂有限公司。溴百里香酚蓝（生物技术级），购自上海麦克林生化科技有限公司。氮气，购自无锡市鑫锡仪科技有限公司。实验用水为超纯水。称取0.072 g磷酸二氢钾，0.531 g十二水合磷酸氢二钠和4.5 g氯化钠于烧杯中，加少量水溶解，转移到容量瓶中并定容至500 ml，配制得到PBS溶液。取5.3 ml的0.2 mol/L的二水合磷酸二氢钠溶液与94.7 ml的0.2 mol/L的十二水合磷酸氢二钠溶液混匀，取10 ml混合液加0.1 g溴百里香酚蓝，配制得到示踪剂溶液。

1.2 分析测试仪器

光学溶氧传感器，SP-PSt3型，德国PreSens公司；翘板摇床，SLK-R3000-S型，美国SCILOGEX公司；Q-Flow转子流量计（0~100 ml/min），瑞士vogtlin。

1.3 实验装置

T25细胞培养瓶冷模实验装置如图1所示，它由翘板摇床、氮气供给系统、空气供给系统、光学溶氧传感器、摄像头以及T25培养瓶等部分组成。在传质实验中，首先通入氮气以置换培养瓶中的溶解氧和气相中的氧气，之后切换为空气，记录液相中溶解氧的变化趋势。在混合实验中，通过摄像头记录示踪剂的混合过程。

图1

图1   T25细胞培养瓶冷模实验装置

Fig.1   Cold-flow experimental setup for the rocking T25 flask micro-reactor system

1.4 实验方法

1.4.1 传质系数

反应器的传质性能一般用体积氧传质系数kLa表征，常用的冷模测量方法是亚硫酸盐氧化法，通过亚硫酸钠和氧发生反应消耗溶解氧进行计算。然而亚硫酸钠溶液的性质与细胞反应体系相差较大，不能反映细胞培养时的真实情况。本实验使用与细胞培养体系性质接近的PBS溶液和动态充氧法[14-16]。动态充氧法辅助设备少，操作简单，对体系影响小，可以使用与实际细胞培养相同或相近的物系进行实验，数据有更好的参考价值。缺点是用于T25培养瓶这类小型反应器时需要微型光学溶氧传感器，成本较高。

本研究所用光学溶氧传感器基于荧光淬灭作用，感应元件为直径5 mm的玻璃贴片，粘贴于培养瓶内的底部，使用前根据制造商说明进行了校准。首先将氮气通入T25培养瓶驱赶PBS中的溶解氧，当溶解氧浓度达到零或较低数值时，停止通氮气并迅速切换为空气，实时监测并记录溶氧浓度的变化，直至溶氧达到饱和。在液相理想混合、气相氧气浓度为常数时，根据式（1）求得体积氧传质系数：

C*−CLC*−CL0=e−kLat$\frac{C^{*}-C_L}{C^{*}-C_{L0}}=e^{-k_{L}at}$(1)

其中，C* 为与气相氧气分压对应的饱和溶氧浓度，mg/L,在动态充氧法中，需要将容器内气相快速置换为空气，才能确定C* 的值；CL0和CL分别为0时刻和t时刻实际测量的溶氧浓度，mg/L。由于光学溶氧传感器的响应时间常数远小于溶氧达到平衡的时间[7]，本实验中忽略传感器响应时间的影响。

1.4.2 混合时间

综合考虑染料的溶解度和颜色强度，选择溴百里香酚蓝作为示踪剂。在翘板摇床一定转速下，使T25培养瓶达到流体力学拟稳态，用一次性巴氏吸管滴加1滴溴百里香酚蓝溶液，通过固定在翘板摇床上与培养瓶同步运动的摄像头以60 帧/秒或120 帧/秒的帧率和640×480分辨率录制混合过程的视频。使用Python语言开发了基于OpenCV的计算机视觉算法对上述视频进行处理。同时，使用了快速傅里叶变换（FFT）过滤掉由于翘板摇床振荡引起的干扰。由于溴百里香酚蓝对红色光吸收最强烈，算法得到整个视野内所有像素红色光强度的标准偏差随时间变化的曲线。当标准偏差不再变化时，即认为混合均匀。本方法不依赖吸光度的绝对值，具有更高的灵敏度和分辨率。此处获得的混合时间还用于后续计算流体力学模型验证。

1.5 计算流体力学模型

1.5.1 几何模型与网格划分

CFD模型的建立和求解使用了Ansys 2020 R2中的Fluent。T25培养瓶底面积25 cm2，高3.0 cm，颈部具有一定角度。装液量为10 ml时，液面高度为0.4 cm，之上为气相。为了减少网格数量，提高计算速度，几何模型只包含方瓶底部的1.5 cm部分。整个几何模型采用六面体结构化网格进行划分，如图2所示。其中，靠近方瓶底部的液相区域进行了加密处理，以提高模型精度，捕捉更多细节。经网格无关性分析，确定最终网格和节点数量分别为344×103和362×103。

图2

图2   T25细胞培养瓶几何模型及网格划分

Fig.2   Geometry and meshing of the T25 flask used in the CFD model

1.5.2 数学模型

由于T25培养瓶中气液两相有明显的分界面，CFD采用VOF多相流模型。在VOF模型中，不同流体组分共用同一套动量方程，仅计算各计算单元内的各流体组分体积分数。两相之间的相互作用只有表面张力，此处设置为72 mN/m。摇瓶的运动通过编译自定义函数(UDF)动态网格实现，其数学表达式为

ω=Acos (2πft)2πf$\omega =Acos\left(2\pi ft\right)2\pi f$(2)

其中，ω$\omega$为培养瓶绕旋转轴的旋转角速度，rad/s；A为振幅，rad，本研究使用的摇床A=0.03889 rad；f$f$为振荡频率，Hz；t为时间，s。运动原点位于距方瓶底部中心3 cm的位置，坐标为（0，0，-0.03）；旋转轴为+Y$+Y$轴，重力加速度指向−Z$-Z$方向（图2）。为确定合适的湍流模型，首先对T25培养瓶的雷诺数进行了分析。培养瓶内为明渠流（open-channel flow），特征长度选用水力半径Rh，其定义式为[17]

Rh=whw+2h$R_h=\frac{wh}{w+2h}$(3)

其中，w为液面宽度，m；h为液层深度，m；分母w+2h$w+2h$为湿周长；相应地，其雷诺数可表示为

Re=ρωmaxrRhμ$Re=\frac{\rho {\omega }_{max}r{R}_h}{\mu }$(4)

其中，ωmax${\omega }_{max}$为摇床运动的最大角速度，rad/s；r为T25方瓶内液面与摇床转轴之间的距离。根据式（4），摇床转速为10~30 r/min时，Re<500，位于层流区，无须湍流模型。转速为60~80 r/min时，Re>1000，选取SST k-ω湍流模型，该模型在较低雷诺数时也有良好的表现[18-19]。对于过渡区（40~50 r/min）的准确模拟较为困难，本文考察并比较了SST k-ω，Transition k-kl-ω和Transition SST模型。

在开始动态网格模拟之前，首先设置ω=0$\omega =0$，在静止状态下使表面张力作用达到平衡，然后启用式（2），用动态网格求解。求解过程中监视体系内平均液速随时间的振荡，直至达到拟稳态。之后，开启组分传输模型并加入示踪剂继续以动态网格求解。由于示踪剂浓度极低，为了不影响体系性质，其理化性质假设与水完全相同，扩散系数采用水的自扩散系数2.9×10-9 m2/s。求解过程中监视体系计算域内多点示踪剂质量分数随时间的变化，直至混合均匀。

剪切应力和能量耗散率是影响动物细胞培养的重要参数，但是直接测量微型反应器内的剪切应力和能量耗散率比较困难，而通过CFD模拟则比较容易获得。剪切应力和总的能量耗散率的表达式分别为

τ=ρk+μS$\tau =\rho k+\mu S$(5)P=∫(ρε+μS2)dV$P=\int (\rho \epsilon +\mu S^2)dV$(6)

其中，τ$\tau$为剪切应力，Pa；ρ$\rho$为流体密度，kg/m3；μ为流体动力黏度，Pa⋅s；k为湍流动能，m2/s2；S为剪切应变率，s-1。ρk$\rho k$为湍流剪切应力，μS$\mu S$为黏性剪切应力。

2 实验结果与讨论

2.1 传质系数

传质性能是细胞培养反应器的关键指标，决定了氧气的供给和CO2废气的排放。细胞生长增殖一段时间后，其进一步生长将受到培养环境中溶解氧的限制。培养所能达到的密度、细胞状态以及生长代谢情况都与培养体系中的溶氧浓度有着直接的关系，同时CO2的分压还会影响培养体系的酸度。

体积传质系数kLa是液膜传质系数kL（m/s）与传质比表面积a（m2/m3）的乘积。静止的培养瓶内kL仅受O2和CO2在液体中的扩散系数影响，而a=1/h$a=1/h$，即其液层高度的倒数[7]。运动过程中，kL和a还受界面更新和能量耗散率的影响。运动不但使气液界面发生形变，增大传质面积，还通过拉伸与压缩气液界面降低液膜传质阻力[20-21]。此外，T25培养瓶瓶盖上的无菌过滤膜还可能产生额外的传质阻力，后者甚至可能成为限制氧传递的主要因素。为了研究其影响，使用注射器针头刺穿过滤膜直接向瓶内注入空气，并与带过滤膜的培养瓶以及开口的培养瓶的传质速率进行了比较。图3展示了几种典型的操作条件组合下溶氧从0达到饱和的过程曲线。结果表明，不同操作条件下的传氧速率有明显差别。30 r/min时由于直接向瓶内通入空气，溶氧达到饱和的速率比40 r/min要高，说明瓶盖处的空气滤膜对氧传递有较大的负面影响。

图3

图3   不同振荡转速与换气方式组合下T25培养瓶中溶氧变化

a—置换氮气,开口无瓶盖;b—置换氮气,刺穿瓶盖通空气;c—置换氮气,盖瓶盖,不通空气;d—未置换氮气,刺穿瓶盖通空气

Fig.3   Evolution of dissolved oxygen under different combinations of rocking speed and aeration method

为了对比不同的通气方式下过滤膜对传质的影响，图4进一步对不同的操作条件组合下的kLa进行了定量分析。需要指出，式（1）可以用来拟合任何一阶响应过程，即便溶氧响应曲线是由瓶盖上的过滤膜决定的，其响应曲线仍然可能符合式（1）。因此，图4中给出的kLa只能认为是“表观传质系数”，即综合各因素表现出的传质系数。若非另有说明，本文讨论的kLa均为表观值。

图4

图4   振荡转速对T25培养瓶表观传质系数的影响

a—置换氮气,开口无瓶盖;b—置换氮气,刺穿瓶盖通空气;c—置换氮气,盖瓶盖,不通空气;d—未置换氮气,刺穿瓶盖通空气

Fig.4   Effect of rocking speed on the apparent mass transfer coefficient

从图4中分析得到，在置换氮气后不通空气条件下，T25培养瓶低转速下（< 60 r/min）开口（a）和盖瓶盖（d）的kLa并无明显差别，说明传质阻力主要在气液界面，而不是瓶口的过滤膜。当转速达到60 r/min及以上时，开口（a）的kLa明显大于盖瓶盖（d）。具体的，60 r/min以下时培养瓶内Re小于1000，处于层流区，因此液膜阻力对扩散传质起主导作用，瓶盖上的空气滤膜的影响不明显；60 r/min时开始向湍流区过渡，液膜传质阻力开始降低，空气滤膜影响瓶内、外的气体交换进而影响瓶内气相中的氧气分压和传质速率。通过刺穿空气滤膜直接通气的情况下，表观传质系数在所有转速下都高于不通气的操作。在盖瓶盖且强制通气条件下，T25培养瓶置换（b）与不置换（c）氮气无明显差别，这是由于本实验中置换氮气所需的时间远远小于溶氧达到饱和所需的时间。

Nienow等[22]研究了一株工业CHO细胞在微型搅拌釜生物反应器（赛多利斯ambrTM 15）内表达IgG4时的传质性能。以水作反应体系时，在装液量为13 ml、转速1500 r/min、气速1.0 ml/min下达到较高的kLa=17.58 h-1。在T25培养瓶中，转速达到60 r/min以上时，图4中的四种条件全部达到或超过了该水平。在刺穿空气滤膜直接通空气时，80 r/min的kLa超过了ambrTM 15的两倍。这主要是培养瓶的比表面积远大于ambrTM15微型搅拌釜，且振荡的方式使气液界面发生形变与搅拌相比能效更高。上述分析表明，振荡的培养瓶更适合对剪切敏感且耗氧量大或密度较高的细胞培养。

综上所述，随着振荡转速提高，T25培养瓶的体积传质系数kLa提高。振荡转速高时，气液界面变化快，交界面积大，流动形态更不规则，更新速率加快，根据穿透理论，传质系数应该更高。若剪切应力在可以承受的范围内，可以选择较高的振荡转速进行细胞培养，以支撑更高的细胞密度。也可在瓶盖上整合一个连接洁净气体的微型接口，适当通入氧气或空气，提高气相中的氧分压，促进氧传递。

2.2 液相混合

混合特性是衡量生物反应器性能的另一关键指标。T25培养瓶体积较小，湍流程度也较低，混合时间不能忽视。尤其是进行高密度培养时，混合可能会影响细胞微环境的均一性。本研究使用示踪剂比色法研究T25培养瓶不同操作条件下的混合时间。典型的70 r/min培养瓶混合过程中原始视频帧、处理后的红色光吸收以及CFD模拟结果如图5所示。与其对应的混合过程吸光度标准差随时间的变化如图6所示。混合时间定义为标准差达到最终稳态值的5%内所需的时间。

图5

图5   70 r/min 时T25培养瓶混合情况及红色光吸收情况与CFD模拟结果的比较

左—原始视频帧;中—红色光吸光度;右—CFD模拟结果

Fig.5   Red light absorbance after tracer addition under 70 r/min rocking compared with CFD simulation

图6

图6   70 r/min时T25培养瓶混合过程红色光吸光度标准差

Fig.6   Evolution of the standard deviation of red light absorbance under 70 r/min rocking

由于翘板摇床上可以放置甚至堆叠多个T25培养瓶，不同位置的培养瓶的重心与摇床旋转轴相对位置不同，有可能会影响传质与混合。图7考察了培养瓶与旋转轴相对位置对混合时间的影响。结果表明，在翘板摇床中央正放、左侧正放以及中央垫高2.5 cm正放三个条件下，混合时间没有明显差别，即培养瓶距离旋转中心的水平和垂直距离对混合时间的影响不明显。这说明影响流体力学性质的是角向加速度（各处相同）而不是线速度（各处不同），符合惯性系统预期。在培养瓶中心轴与摆动转轴成45°放置条件下，培养瓶的瓶壁起到了挡板的作用，混合时间明显小于其他三个条件。在培养瓶中加入覆盖培养瓶底部约2/3区域直径为2 mm的玻璃珠，不同转速下的混合情况如图8所示。与常规操作相比，加入玻璃珠混合时间大大缩短。由图7、图8分析可得，无论培养瓶与旋转轴相对位置如何，有无加入玻璃珠，当振荡频率从30 r/min增加到70 r/min时，混合时间都有明显缩短，从10 min以上降低到1 min以下量级。

图7

图7   振荡转速和旋转轴位置对T25培养瓶混合情况的影响

a—正放;b—培养瓶中心轴与摆动转轴成45°;c—垫高;d—偏左

Fig.7   Effect of rocking speed and axial position on the mixing time

图8

图8   玻璃珠对T25培养瓶混合时间的影响

a—中央正放不加玻璃珠;b—中央正放加玻璃珠

Fig.8   Effect of glass beads on the mixing time

以上分析表明，在翘板摇床上放置多个培养瓶时，不同位置上的培养条件应该十分接近，可以用于培养基的优化等对平行性要求较高的实验。在不影响细胞生长的情况下，在培养瓶中加入不发生反应且对细胞无害的固形物以及设置挡板等有利于反应器内的混合与传质，同时也会增加剪切应力，或可模拟大规模生物反应器细胞培养时的高剪切环境。

2.3 CFD数值模拟

2.3.1 网格无关性验证

首先通过考察网格数量对计算域内的平均液速的影响进行网格无关性分析。以速度大小改变量不超过3%确定最佳网格数量。在80 r/min下使用SST k-ω模型在不同网格数量下计算域内平均液速随时间的变化，结果如图9所示。最终确定模型的网格单元数为344×103。

图9

图9   80 r/min下不同网格数量下计算域内平均液速随时间变化曲线

Fig.9   Grid-independence test by monitoring mass-average liquid velocity magnitude at 80 r/min

2.3.2 过渡区模型的选择

T25培养瓶在40 r/min和50 r/min时，Re分别是637和797，处于过渡区[17]。对层流-湍流过渡区的准确模拟，尤其是使用通用的CFD方法进行并行计算求解是非常困难的[8, 23]。以40 r/min为例，本文考察几种常用的过渡区模型，并通过与20 r/min的Laminar模型与60 r/min的SST k-ω模型进行比较，以便选择较合适的模型进行进一步分析。从图10可以看到，四种过渡区模型给出的40 r/min时液速值均处于20 r/min与60 r/min对应值之间，符合预期。但对于剪切应力而言，40 r/min只有层流模型的剪切应力在20 r/min与60 r/min之间，Transition k-kl-ω模型明显高于60 r/min，其余两模型低于20 r/min；对于能量耗散率而言，40 r/min的Laminar模型同样在20 r/min与60 r/min之间，符合实际情况。综合分析，40 r/min过渡区的情况用通用的湍流模型可能无法准确模拟，后续讨论中用Laminar层流模型近似求解。

图10

图10   不同模型与转速的CFD模拟结果

Fig.10   CFD simulation results by different turbulent models under different rocking speeds

2.3.3 混合时间

在计算流体力学模型求解达到拟稳态后（即平均液速呈现有规律的周期性变化时），在X=0 m，Y=0.005 m，Z=0.003 m处添加0.05 ml质量分数为0.001的液相示踪剂并启用组分传输方程，继续采用瞬时法模拟示踪剂在计算域内的混合过程。求解过程中，在计算域内的不同位置选择多个点监测示踪剂的浓度变化。混合时间定义为所有监测点的示踪剂浓度落入最终稳态值的5%内所需的时间。混合均匀后，模拟结束。

图11给出了70 r/min时T25培养瓶内5个监测点处（图11插图）示踪剂质量分数变化（五条彩色曲线）以及实验测定混合过程红色光吸光度标准差变化（原始信号与FFT滤波后信号）。插图中，中央黑色圆点为示踪剂加样位置，其余灰色点为选定监测点位置。距离示踪剂添加位置较近的监测点，初始示踪剂浓度高；反之则初始浓度几乎为零。前者逐渐降低，后者逐渐增加，直至趋于平衡。FFT滤波后的红色吸收光标准差变化也逐渐平衡。CFD模拟的混合时间与实验测定结果的吻合程度较高，证明相应的模拟方法可以用于混合时间的分析研究，也验证了模型的有效性。

图11

图11   混合过程中培养瓶内不同位置示踪剂质量分数变化与红色吸收光标准差

Fig.11   Evolution of tracer mass fraction at five different points in the T-flask during mixing and the standard deviation of red light absorbance

2.3.4 气液界面形状及面积

本研究所用的细胞培养瓶属于振荡型微型反应器。这类反应器由于不存在分散于液相的气泡，传质面积完全取决于液面面积。一般说来，气液界面的形状受振荡产生的离心力和液体的表面张力决定。具体的，表面张力越高，静止时界面面积越小，发生形变需要的临界转速越高；超过临界转速后，转速越高，界面形变也越大。Hermann等[24]研究了96孔板在不同振荡频率下的液面形状，发现当振荡半径为25 mm时，振荡频率达到200 r/min才能观察到肉眼可见的液面形变。Kensy等[25]在48孔板进行实验时，也有高转速比低转速液面形变明显的结果。T25培养瓶较孔板而言，气液交界面较大，应在较低转速下即可发生较大形变。

图12（a）是本研究中T25培养瓶瓶体在翘板摇床不同转速下达到流体力学拟稳态后再回到水平位置时，在Y=0.5 cm截面气液两相的相对状态，图12（b）是实验过程中气液界面形状的照片。结果表明，CFD模拟结果与摄像头捕获结果相似，在10~50 r/min时气液界面上的形态没有明显差别，皆几乎与水平面平行。而在60~80 r/min时系统开始进入湍流状态，瓶内液体的相对运动状态发生明显变化，气液界面出现明显扰动，面积增大。图13是CFD模拟培养瓶内速度大小分布云图，图14为不同转速下的气液界面面积随振荡时间变化的CFD模拟结果。随着转速提高，气液界面的面积增大，流动形态更不规则，液面更新速率加快，这解释了传质系数随振荡频率增加的现象（图4）。

图12

图12   T25培养瓶在20~80 r/min转速下气液界面状态

Fig.12   Shape of the gas-liquid interface under 20—80 r/min rocking

图13

图13   不同转速下T25培养瓶速度分布云图

Fig.13   Contours of velocity magnitude in T25 flasks under different rocking speeds

图14

图14   不同转速下气液界面面积随时间的变化

Fig.14   Variation of the gas-liquid interfacial area under different rocking speeds

2.3.5 剪切应力

剪切是动态反应器中细胞损伤的主要原因之一，当剪切作用超出细胞膜形变极限时，细胞膜破裂细胞死亡。在使用微载体进行细胞培养时，即便剪切应力不至于直接造成细胞死亡，也可能将细胞从微载体上剥离。本研究中，振荡转速低于40 r/min时培养瓶内的流动为层流，剪切主要为黏性剪切，转速高于60 r/min时，流动开始进入湍流区，此时总的剪切应力需加上湍流的作用，通过式（5）计算总的剪切应力。若要较为准确地模拟湍流剪切应力应使用雷诺应力模型（RSM），由于本研究涉及的60、80 r/min雷诺数较低，k−ω$k-\omega$模型可以满足此处讨论之需要。20 r/min处于层流区，使用Laminar模型，40 r/min处于过渡区，通过前文比较研究选择Laminar模型近似模拟。根据式（5）计算的不同转速下一个振荡周期内的平均剪切应力如图15所示。结果显示，随着转速的增高，平均剪切应力的强度成指数增加趋势。Ghasemian等[26]研究用于干细胞培养的125 ml转瓶（装液量50 ml）和150 ml滚瓶的流体动力学特征时，得出常用操作条件下二者的平均剪切应力范围为0.015~0.046 Pa和0.019~0.044 Pa，范围比本研究所用的方瓶要窄。摇床往复运动改变方向时瓶壁起挡板作用，以及摇床带动整个培养瓶内全部液体同时运动相比转瓶和滚瓶能提供更高的能量输入，使得剪切应力增大。当用于培养工艺研究时，振荡的T25培养瓶能更接近大规模培养反应器内的情况。

图15

图15   转速对质量加权平均剪切应力影响

Fig.15   Effect of rocking speed on the spatio-temporal mass-average shear stress

剪切应力的平均值并不能完全代表它对细胞产生的可能影响，还要考虑培养瓶流场中是否存在局部应力高于细胞承受能力的区域。20、40、60、80 r/min转速下剪切应力的分布情况如图16所示。结果表明，不同转速下的高剪切应力都集中分布在培养瓶瓶壁尤其底面和气液交界面的位置，液层中中间区域的剪切应力明显小于各个接触面。80 r/min时平均剪切应力<200 mPa，而接近瓶底处将近700 mPa，这是较低雷诺数下以黏性剪切为主时，无滑动边界条件的必然结果。振荡的T25培养瓶在较小的体积下能更接近大型反应器，适合用于高通量缩小模型研究。Li等[27]研究口蹄疫灭活疫苗生产中4000 L细胞培养过程的缩小模型时，模拟了14、800和4000 L生物反应器叶轮转速分别为66、48和44 r/min时的剪切应力，发现最大剪切应力在10~100 mPa之间，与T25培养瓶中40 r/min以及60 r/min的模拟结果较为相似。

图16

图16   不同转速下T25培养瓶内剪切应力分布云图

Fig.16   Contours of shear stress in a T25 culture flask under different rocking speeds

2.3.6 能量耗散

对于细胞生物反应器，能量耗散率ε是决定传质、混合和剪切特性的重要因素。ε的宏观表现是比功率输入，俗称P/V（W/m3），其中P（W）是输入总功率，V（m3）是反应器中液体体积。对于传统的搅拌釜反应器，P可以通过转矩测量较为准确地获得，也有比较可靠的经验、半经验公式进行估算[28-29]。对于微型反应器，包括本研究中所使用的T25方瓶，实验测量功率输入比较困难，但可以通过式（6）计算得到。不同转速下一个振荡周期内的平均能量耗散率如图17所示。与搅拌釜反应器类似，能量耗散率随转速的提高呈指数上升趋势[30]。80 r/min时的能量耗散率与其他三个转速有明显的区别，20、40、60 r/min时的能量耗散率都在较低范围内小幅度波动，而80 r/min时，能量耗散率波动幅度剧烈增大，整体的能量耗散率变高，在时间和空间上极不均匀。图18为在几个不同转速下能量耗散率的分布情况，与图15对照可以看出速度高的位置能量耗散率则越高，靠近液面处速度快速降低，能量耗散率也有一定下降。

图17

图17   转速对质量加权平均能量耗散率影响

Fig.17   Effect of speeds on the mass average ε

图18

图18   T25培养瓶能量耗散率分布云图

Fig.18   Contours of the ε distribution in T25 flasks

Nienow等[22]在对ambr® 15微型搅拌釜反应器的CFD模拟中发现在1500 r/min的搅拌转速下，ambr® 15内的液体流动和能量耗散集中在搅拌桨周围较小的区域内，靠近液面处液体流动速度同样迅速下降。李雪良等[8]对ambr® 15及ambr® 250进行了更加详细的CFD模拟，结合实验认为模拟的结果可以用于指导反应器放大，但同时也指出由于ambr® 15内的流动处于从层流到湍流的过渡区，使用湍流模型进行CFD模拟会有较大误差。

3 结 论

通过对置于翘板摇床上的T25培养瓶在不同操作条件下的流体动力学和混合传质特性进行系统性分析，得出以下结论。

(1) 振荡转速对传质系数具有决定性作用，换气方式对传质速率也有一定影响。T25培养瓶综合传质系数可达20~30 h-1，高于相同体积的微型搅拌釜反应器。

(2) 振荡转速对混合时间具有巨大影响，从30~80 r/min，混合时间由数十分钟降低至1 min以下，在培养瓶中加入挡板和玻璃珠可明显促进混合。

(3) VOF模型结合动态网格可以对摇瓶内的多相流运动及混合情况较好模拟，用以获得较难通过实验直接测量的性能参数。

(4) 高转速下，T25培养瓶中剪切应力和能量耗散率在时间与空间上分布极不均匀。瓶壁与气液交界面处局部剪切应力较高，但与市售微型搅拌釜反应器接近。

振荡的T25方瓶最有价值的应用可能还包括微载体悬浮培养，这有待进一步研究。

符 号 说 明