全二维与一维气相色谱质谱联用技术解析苏派黄酒挥发性组分

中国黄酒与啤酒、葡萄酒并称世界三大古酒，是一种以稻米等为原料、以曲为发酵剂酿造而成的低度发酵酒，采用“用曲制酒、双边发酵”的酿造工艺[1]，组分复杂且风味独特。黄酒产区分布广泛，由于原料曲种、生产工艺和酿造环境等因素的影响，各产区的黄酒均有其独特的风味特征。苏派黄酒产自江苏南部地区，是黄酒的主要产区之一，产品风格以清爽型为主，具有“酒色橙黄，清澈透明，醇香清雅，柔和清爽”的风格特点，与其他产区黄酒差异明显。目前针对不同产区黄酒的风味研究已逐步展开[2]，利用现代仪器分析技术解析黄酒中的挥发性组分种类及含量，有助于明晰不同产区黄酒的香气组成及风味特征。

传统的一维气相色谱-质谱联用技术(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)是黄酒香气分析最常用的工具，近年来研究人员常采用顶空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction，HS-SPME)结合GC-MS技术对黄酒挥发性组分进行定性分析，然而受到一维GC-MS峰容量和分辨率的限制，检测时会出现化合物共流出现象，这导致其鉴定的黄酒挥发性化合物往往低于100种[3-5]。全二维气相色谱-飞行时间质谱(comprehensive two-dimensional gas chromatography-time of flight mass spectrometry，GC×GC-TOFMS)相对于一维GC-MS具有高分辨率、高灵敏度和高峰容量等优势[6-7]，第一维色谱柱的所有组分都在第二维色谱柱上进行了正交分离，能够解决一维GC-MS检测时化合物共流出导致的峰掩盖问题。近年来采用GC×GC-TOFMS技术对酒类进行风味解析逐渐成为研究热点，而目前其在黄酒领域应用较少，陈双[8]首次采用GC×GC-TOFMS技术对黄酒挥发性组分进行解析，共检测出975个色谱峰；ZHOU等[9]对黄酒GC×GC-TOFMS检测条件进行了优化，并在浙派黄酒中鉴定出267种挥发性化合物。

GC×GC-TOFMS在挥发性组分的定性分析时展现了其独特的优势，然而一维GC-MS在进行已知化合物的外标法定量分析时仍是简便而有效的工具[2,10-12]。为探明挥发性组分中的关键呈香物质，GC-MS定量分析结合香气活度值(odor activity value，OAV)法是风味化学领域中鉴定关键香气物质的常用手段，OAV的含义为待测香气化合物与其香气阈值的比值，其值大小可一定程度上反映该化合物对整体香气的贡献程度，常以OAV>1作为关键香气物质的判定标准[13-15]。

因此，本研究采用HS-SPME-GC×GC-TOFMS技术对苏派黄酒的挥发性组分进行定性分析，并结合HS-SPME-GC-MS定量分析及OAV法鉴定苏派黄酒中的关键香气物质。本研究通过解析苏派黄酒的挥发性组分特征，为中国黄酒风味化学理论体系提供了基础数据，同时为风味导向的苏派黄酒品质控制提供了理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验样品

本研究所用苏派黄酒样品由中国江苏地区某公司提供，包括4款半干型和2款半甜型商品酒，样品具体信息如表1所示。

表1 苏派黄酒样品信息
Table 1 Information of Jiangsu Huangjiu samples

1.1.2 主要试剂

C7～C30正构烷烃、乙酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯、2-羟基-4-甲基-戊酸乙酯、丁二酸二乙酯、异戊酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、苯甲酸乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯丙酸乙酯、异戊醛、苯甲醛、己醛、癸醛、苯乙醛、正丙醇、正丁醇、异丁醇、异戊醇、正己醇、苯甲醇、1-辛烯-3-醇、β-苯乙醇、2-辛醇、丁酸、异戊酸、己酸、辛酸、4-乙烯基愈创木酚、愈创木酚、苯酚、4-乙基愈创木酚、4-乙基苯酚、糠醛、5-甲基呋喃醛、丙位壬内酯、2,5-二甲基吡嗪、2-乙基吡嗪、二甲基三硫(色谱纯)，美国Sigma-Aldrich公司；氯化钠、乳酸、乙醇(分析纯)，中国国药上海化学试剂公司。

1.2 仪器与设备

Pegasus GC-HRT 4D+全二维气相色谱-高分辨飞行时间质谱仪，美国LECO公司；PAL RTC自动进样系统及孵化炉和加热搅拌模块，瑞士CTC analytics AG公司；Thermo Trace1300-ISQ气相色谱-质谱联用仪、TR-FFAP色谱柱(30 m×0.25 mm ID，0.25 μm)、TG-WAXMS色谱柱(30 m×0.25 mm ID，0.25 μm)，美国Thermo Fisher公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS三项萃取头，美国Supelco公司；Rxi-17 sil MS色谱柱(1 m×0.25 mm ID，0.25 μm)，美国Restek公司；手动固相微萃取进样器，德国Gerstel公司；Mili-Q型超纯水仪，美国Millipore公司；DF-101S型恒温搅拌水浴锅，郑州科泰实验设备有限公司；ME204TE型分析天平，瑞士Mettler-Toledo公司。

1.3 实验方法

1.3.1 HS-SPME-GC×GC-TOFMS技术解析黄酒挥发性组分

1.3.1.1 HS-SPME-GC×GC-TOFMS前处理方法

参照文献[16]方法进行。取3 mL黄酒样品与3 mL超纯水于15 mL顶空瓶中，加入3 g NaCl后迅速盖上瓶盖。样品平衡15 min，吸附30 min，萃取温度50 ℃，不分流进样，解析时间5 min。由PAL RTC系统自动进样，每个样品相同条件下进样3次。

1.3.1.2 GC×GC-TOFMS仪器条件

GC×GC条件：一维色谱柱TR-FFAP，二维色谱柱Rxi-17 sil MS。进样口温度250 ℃，不分流进样。起始温度40 ℃，保持2 min，以5 ℃/min的速率升温至230 ℃保持7 min。调制器调制时间4 s，热脉冲时间1.2 s。二维柱温箱的温度全程比一维柱温箱高5 ℃。以高纯氦气作为载气，恒流模式。流量：1 mL/min。

TOFMS条件：采用EI离子源，温度280 ℃，电离能量70 eV，传输线温度240 ℃，检测器电压1 400 eV，采集质量数范围(m/z)为33～400 amu，采集频率100 spectrum/s。

1.3.2 HS-SPME-GC-MS技术定量分析黄酒香气化合物

1.3.2.1 HS-SPME-GC-MS前处理方法

取2 mL黄酒样品与4 mL超纯水于15 mL顶空瓶中，加入2 g NaCl充分摇匀，加入10 μL 2-辛醇溶液(101.8 mg/L)，放入转子并盖上瓶盖。将老化好的SPME萃取头通过瓶盖隔垫插入样品萃取瓶的顶空，推出纤维头，使其暴露于萃取瓶的顶空中，放入50 ℃恒温水浴中萃取50 min，磁力搅拌速度200 r/min，每次萃取要使纤维头与提取液液面保持相同的高度。标准曲线绘制：准确称取一定质量的各香气化合物标准品，并用黄酒模拟液(pH 4.0，酒精度15%vol)稀释得到一系列不同浓度梯度的混合标准溶液，与样品相同进样，根据目标物与内标物的峰面积比值和浓度绘制标准曲线。

1.3.2.2 HS-SPME-GC-MS仪器条件

GC条件：毛细管色谱柱TG-WAXMS。载气为高纯氦气(>99.999%)，流速1.0 mL/min，进样口温度250 ℃。升温程序：初始温度40 ℃保持2 min，以5 ℃/min升温至230 ℃，并保持10 min。

MS条件：EI离子源，温度280 ℃，电离能量70 eV，传输线温度240 ℃。质量扫描范围33～350 amu。

1.4 数据分析

1.4.1 GC×GC-TOFMS数据分析

由LECO公司Pegasus 4D工作站进行数据采集，在ChormaTOF软件平台上进行数据分析，自动识别相似度>700的色谱峰后进行自动积分解卷积和谱库比对。使用Microsoft Excel筛选信噪比(S/N)≥50与不含卤素及硅元素的化合物后通过保留指数(由相同条件下C7～C30计算得出)定性。

1.4.2 GC-MS数据分析

数据由Thermo TraceFinder GC软件进行采集及定量分析。

2 结果与分析

2.1 HS-SPME-GC×GC-TOFMS解析苏派黄酒挥发性组分

黄酒作为一种发酵酒，使用传统一维气相色谱质谱分析其挥发性组分时容易出现化合物共流出现象，分辨率低、灵敏度低和峰容量低等缺点影响了黄酒挥发性化合物的鉴定效果，无法满足科研工作者对黄酒风味解析的需求。而全二维气相色谱-飞行时间质谱技术在一维气相色谱分离的基础上进一步使用不同性质色谱柱进行第二次分离，大大减少了一维色谱峰掩映的问题，同时结合飞行时间质谱技术可以有效提高分析的分辨率和灵敏度，适用于诸多复杂酒精饮料体系的挥发性组分鉴定[17-19]。

a-一维；b-二维
图1 苏派黄酒HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析 总离子流色谱图
Fig.1 Analytical total ion chromatogram contour obtained from the HS-SPME-GC×GC-TOFMS analysis of Jiangsu Huangjiu

使用HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析苏派黄酒挥发性组分，以其中一款苏派黄酒全二维色谱图为例，图1-a与图1-b分别为苏派黄酒一维与二维总离子流图，在图1-b中每一个黑点代表仪器识别出的一个色谱峰，在该样品中共识别出了818个色谱峰，表明苏派黄酒挥发性组分复杂，由图1-b可以看出存在许多一维保留时间相同、二维保留时间不同的化合物，说明苏派黄酒在一维总离子流图中存在化合物共流出现象(图1-a)。各苏派黄酒样品在一维气相色谱中均出现化合物共流出现象，而通过二维短色谱柱进一步分离，在一维长色谱柱上共流出的物质分离效果良好，说明GC×GC-TOFMS适用于黄酒体系挥发性组分的鉴定。

GC×GC-TOFMS在苏派黄酒中共鉴定出了432种挥发性化合物(表2)，其中酯类、醇类、醛类和芳香族化合物占总数的50%以上，分别鉴定出87、47、47和45种。酯类物质数目最多，占挥发性化合物总数量的20.1%，这与浙派黄酒研究报道一致，而与即墨黄酒不同，说明不同产区黄酒的挥发性组分有一定差异。

醇类物质是酒精饮料中重要的挥发性化合物，对黄酒风味轮廓和舒适度等具有重要影响。碳原子数大于2的醇类在饮料酒行业通常被称为高级醇，有研究认为其含量高容易造成头疼和深醉，生产过程中应注意其含量控制。黄酒高级醇主要包括正丙醇、异丁醇、异戊醇和β-苯乙醇等[9]。苏派黄酒中醇类物质占总挥发性化合物数量的10.9%，β-苯乙醇呈玫瑰花香[8]，1-辛烯-3-醇具有蘑菇香气[8]，正己醇具有植物生青的香气特征[16]等，它们对黄酒的香气具有一定贡献，同时也是黄酒中酯类化合物的重要前体。

表2 苏派黄酒HS-SPME-GC×GC-TOFMS鉴定出的挥发性化合物
Table 2 Qualitative volatile compounds of Jiangsu Huangjiu by HS-SPME-GC×GC-TOFMS

注：1芳香族化合物不包括醇、醛、酮、酸、酯等其他类别物质中包含苯环的化合物；2其他包括缩醛类、醚类、烯烃、杂环类等化合物

醛、酮类物质通常感官阈值较低，可能对黄酒的香气具有一定的贡献。苏派黄酒中共鉴定出80个醛、酮类物质，占总量的18.5%。鉴定出的醛类化合物以脂肪醛类为主，苯甲醛具有杏仁香[14]，苯乙醛具有花香，己醛和壬醛具有青草香，肉桂醛具有肉桂香，2-苯基-2-丁烯醛具有甜香等。酮类化合物有苯乙酮、苯丙酮、2-庚酮和2-壬酮等，其中2-壬酮与苯乙酮具有花香，诸多羰基类化合物共同丰富了黄酒的香气。

挥发性有机酸造就了黄酒香气的酸味特征，酸类物质占总量的6.0%。黄酒中含有乙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸和癸酸等脂肪酸类，乙酸具有醋酸味，丁酸、己酸、庚酸、辛酸和壬酸呈现出奶酪的气味，它们赋予了苏派黄酒独特的酸香特征，对黄酒的整体香气有重要影响[14]。

酯类化合物是各种饮料酒[17-19]中含量最为丰富的一类挥发性化合物之一，常常具有水果的香气，苏派黄酒中共鉴定出87种酯类化合物，是其最丰富的一类物质。酯类物质主要由脂肪酸酯化生成，乙酯类化合物在酯类化合物中占绝对优势，如乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯、异戊酸乙酯、2-羟基-4-甲基-戊酸乙酯、丁二酸二乙酯、己酸乙酯、苯甲酸乙酯、辛酸乙酯、苯乙酸乙酯、苯丙酸乙酯和2-羟基-3-苯基丙酸乙酯等，此外还有乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯和邻苯二甲酸二异丁酯等其他非乙酯类化合物。乙酸乙酯具有类似溶剂的气味，乳酸乙酯、丁酸乙酯和己酸乙酯等诸多酯类化合物具有水果的甜香气息，而苯甲酸乙酯与苯乙酸乙酯等芳香族乙酯类化合物则呈花香气味，乙酸乙酯、己酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸异戊酯和丙酸乙酯是对黄酒香气影响较大的酯类物质[14]。

呋喃、吡喃类化合物是黄酒中一类不可忽视的香气物质，苏派黄酒中共鉴定出19种呋喃、吡喃类物质，占总量4.4%，包括糠醛、5-甲基糠醛、2-戊基呋喃、乙基糠基醚、5-羟甲基糠醛、2-糠酸乙酯和2,5-二甲酰基呋喃等，糠醛具有苦杏仁与焦糖香，5-甲基糠醛呈现出植物青香，2-糠酸乙酯具有花香气味，乙基糠基醚可能具有特殊的杏仁与烤甜香[16]。一些呋喃类化合物如糠醛和5-甲基糠醛是糖降解和美拉德反应的典型产物[20]，对于研究黄酒加工过程中还原糖反应具有一定价值。

萜烯及其衍生物广泛存在于天然产物之中，苏派黄酒中鉴定出的萜烯及其衍生物有α-松油醇、柏木脑和橙花基丙酮等，它们大多来自天然植物精油中，具有独特的香气，如α-松油醇具有花香，其对苏派黄酒的香气可能有一定贡献。

黄酒中含有许多挥发性与不挥发性酚类化合物，苏派黄酒中共鉴定出10种酚类化合物，主要有苯酚、4-乙基苯酚和4-乙基愈创木酚等。4-乙基苯酚具有药香味，4-乙基愈创木酚具有香料的气味，它们可能是对黄酒烟熏香有重要贡献的物质。

含硫化合物的气味通常被描述为臭鸡蛋与烂白菜等令人不愉快的气味，但在低浓度时可能对令人满意的葡萄酒香气有重要贡献[21]。黄酒中最具代表性的含硫化合物是二甲基三硫，它具有烂白菜的气息，此外在苏派黄酒中都检测到了具有烧烤与坚果气味的2,5-二甲基-3-乙酰基噻吩，它们对苏派黄酒的风味多样性可能有一定的贡献。有报道称黄酒中含有3-甲硫基丙醛和3-甲硫基丙醇[8,22]，其在苏派黄酒中也被检出。

苏派黄酒中共鉴定出14种内酯类化合物，主要有γ-丁内酯、δ-戊内酯、γ-己内酯和5-戊基-2(5H)-呋喃酮等，许多内酯类化合物具有水果香气，γ-丁内酯与γ-己内酯具有甜香气息[8]。

2.2 HS-SPME-GC-MS结合香气活度值解析苏派黄酒关键香气物质

黄酒中挥发性化合物种类繁多、组成复杂，由于化合物本身呈香性质及其香气阈值的限制，并非所有挥发性化合物均对黄酒的香气具有贡献，因此有必要采用一维GC-MS定量分析结合香气活度值法(OAV)鉴定苏派黄酒中的关键香气物质。

在GC×GC-TOFMS定性结果中进一步筛选出37种黄酒中重要香气化合物进行HS-SPME-GC-MS定量分析[1,13-14]。结果显示，37种香气化合物中共有19种化合物含量高于其香气阈值，其中半干型和半甜型黄酒中分别有17种和18种(表3)，它们可能对苏派黄酒整体香气具有重要贡献，为苏派黄酒中关键香气物质。

表3 两种甜型苏派黄酒关键香气物质含量及OAV比较
Table 3 Comparison of concentrations of key aroma compounds and OAV of two sweet-type Jiansu Huangjiu

注：1香气阈值出自文献[8]；2香气阈值出自文献[13]；3香气阈值出自文献[23]；a仅在半干型苏派黄酒中OAV>1的化合物；b仅在半甜型苏派黄酒中OAV>1的化合物

3 结论

本研究首次采用HS-SPME前处理结合GC×GC-TOFMS技术对中国江苏地区黄酒的挥发性组分进行了解析，研究发现相比于传统一维气质联用技术，GC×GC-TOFMS拥有更高的分辨率与灵敏度，通过二维短色谱柱进一步分离，在一维长色谱柱上共流出的物质分离效果良好，说明GC×GC-TOFMS适用于黄酒体系挥发性组分的鉴定。通过质谱库检索与保留指数比对，在苏派黄酒中共鉴定出432种挥发性化合物，其中半干型和半甜型黄酒分别有203和119种，酯类化合物数目最多。使用HS-SPME结合GC-MS对苏派黄酒中37种挥发性化合物进行定量及香气活度值分析，发现19种化合物含量高于其香气阈值，其中半干型和半甜型黄酒分别有17和18种，可能为苏派黄酒中关键香气物质。本研究丰富了中国黄酒风味化学理论体系，为风味导向的苏派黄酒品质控制提供数据支持，对今后不同地区黄酒挥发性组分解析具有一定的指导意义，但本研究仅从定性及定量角度解析苏派黄酒的挥发性组分，各香气化合物对苏派黄酒的感官贡献及香气相互作用仍值得进一步探究。