全二维气相色谱-飞行时间质谱法分析馥合香白酒中挥发性特征组分

中国白酒具有2000多年的酿造历史，其中，复合香型白酒独特的酿造工艺主要体现在发酵容器、制曲工艺、酿造工艺等方面[1]。黄淮地区属于中国名酒产地的集中区域，以传统“老五甑”工艺酿造生产的浓香型白酒为主，此外还拥有“淡雅浓香”、“浓酱兼香”、“多香复合”等不同风格的白酒类型，其酿造工艺各具特色。金种子馥合香白酒作为黄淮名酒带复合香型白酒的典型代表，采用“多曲并用、高温堆积、分层出醅、分类蒸酒”等工艺，“泥底砖壁”窖池作为发酵容器，具有“复合香气幽雅协调，酒体醇厚丰满”的风格特点[2]。

白酒中的风味物质多属于微量或痕量成分，进行分离和浓缩等预处理是白酒风味分析的重要步骤，常用的预处理方法包括液液萃取法、液液微萃取法、固相萃取法、固相微萃取法(solid phase microextraction，SPME)，包括顶空固相微萃取法(headspace-SPME，HS-SPME)、同时蒸馏萃取法和搅拌棒吸附萃取法等。其中，HS-SPME无需溶剂且操作简单快速[3]。全二维气相色谱-飞行时间质谱(two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry，GC×GC-TOF-MS)技术是20世纪90年代逐渐发展起来的新型分离技术，相较于传统的一维气相色谱，该技术具有分辨率高、灵敏度高、峰容量大等特点，是实现复杂样品挥发性组分分离鉴定的有效工具[4]。

当前，GC×GC-TOF-MS技术已应用于多种香型白酒的挥发性组分分析，提高了白酒挥发性组分的分析检测水平。ZHU等[5]应用该技术在茅台酒中共鉴定出528种成分，还研究了一些重要芳香化合物对茅台酒风味的贡献。YAO等[6]应用该技术鉴定了泸州老窖的风味成分，发现了24种具有生物活性的化合物，并且有数百种化合物被认为是泸州老窖白酒的特殊风味来源。然而，关于复合香型白酒中挥发性特征组分的GC×GC-TOF-MS分析报道较少，关于黄淮名酒带复合香型白酒特征组分的分析更为少见。本实验采用顶空固相微萃取结合全二维气相色谱-飞行时间质谱(headspace solid-phase microextraction combined with comprehensive two-dimensional gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry，HS-SPME-GC×GC-TOF-MS)技术首次对黄淮名酒带的复合香型(金种子馥合香)白酒进行挥发性成分分析，并解析其特征组分，有助于增进对馥合香白酒香气特点及其特征组分的认识，为深入研究黄淮白酒的风味特征提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

实验酒样：不同质量等级的馥合香原酒，特级酒(以下称JF1，酒精度63%vol)、优级酒(以下称JF2，酒精度50%vol)，安徽金种子酒业股份有限公司。

试剂耗材：NaCl(化学纯)、无水Na2SO4等，中国医药集团化学试剂有限公司；超纯水由Milli Q纯水仪制备(Milli-Q系统)，美国Millipore公司；DVB/CAR/PDMS固相微萃取三相头(2 cm,50/30 μm)，上海Sigma-Aldrich贸易有限公司。

仪器设备：全二维气相色谱-飞行时间质谱仪系统：7890A Agilent气相色谱仪、Pegasus 4D飞行时间质谱联用仪，美国Leco公司。

1.2 实验方法

HS-SPME实验方法：参照文献[7]的方法，并在萃取时间上略有调整。取5 mL酒样加入20 mL顶空瓶中，加盖密封，采用DVB/CAR/PDMS纤维头，对顶空瓶中的样品进行SPME萃取；50 ℃恒温15 min后，萃取30 min，立即插入GC进样口250 ℃解吸附5 min，再进行GC×GC-TOF-MS分析，同条件下进样3次。

分析方法：参照文献[8]，全二维气相色谱-飞行时间质谱仪的第一维柱为DB-WAX(30 m×250 μm×0.25 μm)，进样温度250 ℃，初始温度40 ℃保留5 min，以5 ℃/min升至220 ℃，以20 ℃/min升至250 ℃，保留2.5 min；氦气(99.999 9 %) 1.0 mL/min，无分流。第二维柱为DB-17MS(2 m×100 μm×0.10 μm)，柱温高于第一维柱5 ℃，调制解调器温度始终保持高于第二维柱5 ℃，全二维分析调制周期4.0 s，接口温度270 ℃，离子源温度250 ℃，电子轰击源70 eV，检测器1 680 V，采集率50张/s，质谱扫描范围m/z 29～500，采用NIST谱库。

质谱条件：电子轰击离子源(electron impact ionization，EI)，电压70 eV，离子源温度230 ℃，传输线温度280 ℃；检测器电压1 365 V，采集质量数35～500 amu、频率100 spectrum/s，由Leco公司Pegasus4D工作站控制数据采集。

GC×GC-TOF-MS数据处理：采集的TOF-MS数据由Leco公司Chroma TOF工作站进行数据处理，自动识别信噪比>50的色谱峰，并自动和质谱库比对。采用NIST 14和Wiley 9质谱库，自动比对生成的“峰表”，再经过人工解谱与同系物二维色谱出峰规律比对，作为初步鉴定结果；最后，去除烷烃类等没有风味贡献的化合物，再选择相似度与反相似度均>700，且可能性>4 000的化合物，并在Chroma TOF软件中建立保留指数计算方法，确定化合物一维色谱柱保留指数，再与文献报道的保留指数比对，选择数值差异≤50的化合物作为最终鉴定结果[9]。

2 结果与分析

2.1 HS-SPME-GC×GC-TOF-MS技术应用于馥合香白酒挥发性组分分离的特性分析

全二维气相色谱把分离机理不同而又互相独立的2根色谱柱串联，其中第一维通常采用非极性的长色谱柱，根据分离物的沸点差异进行分离；第二维通常采用极性或中等极性的短色谱柱，根据分离物的极性差异进行再分离。DB-WAX色谱柱的使用温度下限为20 ℃，改善了低沸点分析物的分离度；DB-17MS色谱柱属于中等极性色谱柱，能够为活性化合物分析提供极佳的惰性，极低的柱流失性能使其适用于多种GC/MS应用。基于上述原则，本实验采用一维DB-WAX色谱柱搭配二维DB-17MS色谱柱对馥合香白酒中挥发性组分进行分析，如图1所示，全二维分析谱图表明馥合香白酒中的挥发性组分较为复杂，其中的一维色谱图中有大量化合物存在共流出现象，通过二维色谱分离获得了一定的分离效果，采用该技术在馥合香特级酒中共检测到729个色谱峰。

a-1D总离子流色谱图；b-2D总离子流色谱图
图1 基于HS-SPME-GC×GC-TOF-MS法JF1的 1D和2D总离子流色谱图
Fig.1 1D and 2D total ion flow chromatogram of JF1 based on HS-SPME-GC×GC-TOF-MS 注：图中黄色或绿色的亮点表示1个色谱峰

2.2 馥合香白酒中挥发性组分的HS-SPME-GC×GC-TOF-MS分析鉴定

香气物质的完全分离为评价香气物质对白酒品质的贡献度提供了可靠依据。通过分析表1鉴定出的化合物统计可知，JF1、JF2中共鉴定出可信度较高的挥发性组分分别为341和303种。其中，酯类分别为117和105种，醇类分别为70和61种，有机酸类分别为43和44种，醛、酮、缩醛类分别为47和40种，挥发性含硫化合物分别为14和11种，含氮化合物分别为9和8种(其中，吡嗪类分别为7和6种)，呋喃类均为16种，其他类化合物分别为25种和18种。

表1 基于HS-SPME-GC×GC-TOF-MS法在馥合香 白酒中分析鉴定出的化合物统计 单位:种

Table 1 Statistics of compounds identified in Fuhe-flavor Baijiu by HS-SPME-GC×GC-TOF-MS

2.2.1 含硫化合物

挥发性含硫化合物的香气阈值极低，香气独特，在大多数食品尤其是酒精饮料中含量极低，对其进行检测也具有一定的挑战性[10]。从馥合香白酒中分析鉴定出的含硫化合物如表2所示。JF1、JF2中分别为14和11种，其中的三甲基二硫呈强烈逸发性冷的薄荷气味和浓烈辛香香气，类似新鲜洋葱气味，硫代丁酸S-甲酯具有乳酪、番茄、硫化物样香气，2-噻吩甲醛具有类似杏仁香气。馥合香白酒酿造过程中高温大曲与芝麻香曲的应用，促进了发酵过程中耐高温细菌菌群的代谢，有利于原料蛋白质的分解与转化，进而产生具有不同香气特点的含硫化合物，可能对馥合香白酒的香气特征具有积极贡献。

挥发性含硫化合物对芝麻香型白酒的风味贡献是白酒风味化学研究的热点，在芝麻香型白酒中检测到多种特征性含硫化合物，如3-甲硫基丙醇、3-甲硫基丙醛、3-甲硫基丙酸乙酯、二甲基三硫等。本实验在馥合香白酒中鉴定出多种挥发性含硫化合物，如三甲基二硫、二甲基二硫等，这可能与馥合香白酒的酿造工艺吸收与借鉴了芝麻香型白酒的酿造工艺有关，

表2 基于HS-SPME-GC×GC-TOF-MS法在馥合香白酒中分析鉴定出的含硫化合物
Table 2 Sulfur compounds identified in Fuhe-flavor Baijiu by HS-SPME-GC×GC-TOF-MS

注：a)一维色谱保留时间；b)二维色谱保留时间(下同)

对含硫化合物在特定含量下的复合香气及其对馥合香白酒的香气贡献还有待深入研究。

2.2.2 呋喃类化合物

呋喃类化合物是构成许多天然食品香气特征的重要成分，具有阈值低、香气独特等特点，包括呋喃脂类、呋喃含硫类、酰基呋喃类、其他呋喃类化合物等[11]。研究发现，呋喃类物质是酱香型白酒的重要呈香物质和特征化合物[12]。从馥合香白酒中分析鉴定出的呋喃类化合物如表3所示，JF1、JF2中均检测到16种，其中的乙酸糠酯具有果香、药香、辛香，2-乙酰基-5-甲基呋喃具有特殊香味，5-甲基-2-呋喃甲醛具有辛香、甜香、焦糖样的香气，2-戊基-呋喃具有豆香、果香、泥土、青香及类似蔬菜的香气。苯并呋喃类和呋喃酮类化合物均具有药用或健康功能价值[13]，馥合香白酒中检测到的呋喃类化合物可能对其独特香气及健康价值具有积极贡献。

表3 基于HS-SPME-GC×GC-TOF-MS法在馥合香白酒中分析鉴定出的呋喃类化合物
Table 3 Furan compounds identified in Fuhe-flavor Baijiu by HS-SPME-GC×GC-TOF-MS

馥合香白酒酿造过程中的蒸馏环境、酒醅组成以及酿酒工艺等是影响酒体中呋喃类化合物种类及含量的重要因素，酿酒大曲以及酒醅是原酒中呋喃类化合物的重要来源；此外，糠醛的产生还与蒸馏环境有重要关系，当酒体中的糠醛含量比其他成分略多时，酒体呈现焦香风味，当糠醛的含量较多时，酒体则显现酱香风味。因而，不同质量等级的馥合香白酒均呈现出一定的“焦香、酱香”等香气特征。

芝麻香型白酒中的特殊风味成分以吡嗪类化合物为主，辅以呋喃类、酚类、噻唑、含硫化合物等，其相互影响构成了酒体的复合香气。呋喃类化合物在酱香型白酒中的含量相对较高，是酱香型白酒的重要标志组分。本实验在馥合香白酒中均检测到呋喃类、酚类、噻唑、含硫化合物等特殊风味成分，此类化合物可能对馥合香白酒的香气特征起到重要作用。

2.2.3 含氮化合物(包括吡嗪类化合物)

白酒中的含氮类化合物以吡嗪类为主，该类化合物通常具有强烈的坚果、焙烤、咖啡、焦香等香气特征，对改善白酒的口感、促进白酒的香气优雅具有积极作用[14]。有研究从不同香型白酒中检测到多种含氮化合物，其主要有噻唑、吡啶、吡嗪及其他衍生物等[15]。本实验从JF1、JF2中检测到的含氮类化合物分别为9和8种(表4)，包括吡嗪类化合物分别为7和6种，其中的噻唑具有特殊臭气。

表4 基于HS-SPME-GC×GC-TOF-MS法在馥合香白酒中分析鉴定出的含氮化合物
Table 4 Nitrogen-containing compounds identified in Fuhe-flavor Baijiu by HS-SPME-GC×GC-TOF-MS

馥合香白酒酿造中，高温大曲、中温大曲和芝麻香曲等分工艺阶段使用，芝麻香曲复配组分的细菌曲以耐高温产蛋白酶嗜热细菌菌群为主，在粮醅堆积及入池发酵过程中促进了原料蛋白质的分解，均有可能产生具有不同香气特点的含氮化合物。酒体中吡嗪类、吡啶类、吡喃类及噻唑类等组分，主要来源于高温大曲的高温制曲、粮醅的高温堆积及酒醅的高温发酵等过程，该类化合物对馥合香白酒的风味贡献较大。

吡嗪类化合物广泛存在于天然和发酵食品中，是白酒中重要的呈香呈味物质及健康功能因子[16]。酱香型白酒中吡嗪类化合物与酱香型白酒的感官特征密切相关，其含量对酱香型白酒的品质具有重要影响。然而，对于馥合香白酒中吡嗪类化合物的研究还比较鲜见。

本实验从JF1、JF2中检测到的吡嗪类化合物分别为7和6种，吡嗪类物质阈值极低，通常对酒体风味具有正向贡献。其中，2-乙基-6-甲基-吡嗪具有坚果、焙烤和甜香香气，2,5-二甲基-吡嗪具有刺鼻的炒花生香气和巧克力、奶油香气，2-甲基吡嗪具有似牛肉加热时发生的香味和果仁及可可似香味，三甲基吡嗪具有巧克力、果仁及可可香气，四甲基吡嗪具有特殊的坚果香气，2,6-二甲基吡嗪具有咖啡和炒花生的香气。部分吡嗪类物质还具有健康功能，如四甲基吡嗪具有够扩张血管、改善微循环及抑制血小板积聚，保肝、护肝等功效[17]，2-甲基吡嗪和三甲基吡嗪均具有抗氧化功能[18]，且2-甲基吡嗪可以改善高血糖，并具有分解甘油三酯的能力[19]。

馥合香白酒中检测到的吡嗪类化合物均具有特殊香气，这与馥合香白酒具有“芝麻香、酱香”等香气特征密切相关，部分具有健康功能的吡嗪类化合物可作为馥合香白酒重要的特征性组分。馥合香白酒酿造过程中，粮醅经高温堆积产生与积累的风味物质及其前驱物(包括吡嗪类化合物)，尤其是经过美拉德反应促进了“焦香”等特殊香气物质的生成，这类化合物在发酵过程中溶入到酒醅中，再通过“分层出醅、分类蒸酒”等工序溶入到酒体中，有助于增加酒体中的“芝麻香、酱香”等香气成分。

2.3 不同质量等级馥合香白酒的主要香气成分对比

图2是馥合香白酒中主要香气成分的种类占比分布图，JF1、JF2中各香气成分的种类占比相近，其中占比最高的均为酯类化合物，其次为酸类和醇类，占比最低的是吡嗪类化合物。馥合香白酒的酿造以“泥底砖壁”窖池作为发酵容器，窖池底部的窖泥中富含己酸菌等产酯微生物菌群，己酸乙酯等酯类化合物具有水果香气，赋予酒体特殊的愉悦香气。适量的酸类化合物对酒体的风味感官起到缓冲作用，并在酒体贮存过程中缓慢形成具有特殊香气的酯类。醇类化合物是酒体中醇甜和助香的主要物质，也是形成各类香气物质的前驱体，其中高级醇还具有赋予酒体特殊香气并衬托酯香的作用，使酒体的香气更加协调。

a-JF1；b-JF2
图2 馥合香白酒中主要香气成分的种类占比分布图
Fig.2 Percentage of species distribution of main aroma components in Fuhe-xiang Baijiu

馥合香白酒中酯类、醇类和酸类等占比在75%以上，其对馥合香白酒的香气起到主要作用；其他类化合物的种类占比均较低，但其中的某些阈值较高的化合物，可能对馥合香白酒独特香气的形成具有重要作用。馥合香白酒的整体香气特征可能是由多种香气活性成分共同作用形成的。其中，分子质量较高的醛、酮类物质具有类似橘子皮的香气，支链醛、酮类物质具有愉快的甜味或水果香气，含硫化合物主要呈现烤肉、菜叶的香气，特殊的含氮、含硫化合物可能与其酿酒原料或酿酒工艺等带来的丰富蛋白质有关。

馥合香白酒酿造用曲的微生物种类较多、工艺较复杂，还存在微生物之间的相互影响等作用，发酵过程中的“产酒、生香、呈味、风格”等同时形成并交叉进行，促使了馥合香白酒形成较为丰富的香气物质。目前，白酒样品的检测分析技术有限，且受到样品前处理方法的制约；因此，馥合香白酒的主体香气成分及其特征性组分还有待于进一步研究。

3 结论

白酒酿造过程中的发酵原料、制曲与酿酒工艺、窖池类型及地域环境等因素对酿酒微生物菌群及其代谢具有重要影响，形成不同的风味物质及特征组分，进而影响白酒的风格特点与香型分类，不同香型白酒均具有典型的风味物质或特征组分[20-21]。本实验采用HS-SPME结合GC×GC-TOF-MS技术首次针对黄淮名酒带的复合香型白酒(馥合香白酒)进行挥发性成分分析，并解析其组分特征，得到以下结论：(1)JF1中检测出729个色谱峰，鉴定出可信度较高的挥发性化合物341种，体现了馥合香白酒挥发性组分的复杂性；(2)JF1、JF2中检测到的挥发性含硫化合物分别为14和11种，作为酒体中的微量成分，其含量与香气阈值均极低，可能对馥合香白酒的香气特征具有重要贡献；(3)JF1、JF2中检测到的呋喃类化合物均为16种，特殊香气及功能性的呋喃类化合物可能对馥合香白酒独特的香气及健康价值具有积极贡献；(4)JF1、JF2中检测到的吡嗪类化合物分别为7和6种，具有独特香气和生理功能的吡嗪类化合物可作为馥合香白酒重要的特征性组分。馥合香白酒中鉴定出的挥发性含硫化合物和吡嗪类化合物，均可作为馥合香白酒的特征性组分。然而，本实验对酒体中各风味物质的香气协同作用还有待深入研究。