结构甘油酯定向合成进展及其应用

甘油酯的脂肪酸组成和位置决定着甘油酯的物理化学特性、生理代谢功能和营养价值。结构甘油酯(structural glycerides)指利用生物催化剂(如脂肪酶)或化学催化剂(如甲醇钠)改变甘油酯的脂肪酸组成或者位置而得到的一类酯, 天然甘油酯成分中的脂肪酸随机性较大，不能满足人们需求。例如，天然油脂中甘油三酯(硬脂酸甘油酯、软脂酸甘油酯、油酸甘油酯等)占93%～95%，甘油二酯占5%。天然甘油酯上的脂肪酸位置以及种类随机分布带来人体健康问题，例如长期食用长链甘油三酯不仅导致脂肪堆积和“三高并发症”，还会导致必须氨基酸缺乏和肠胃病。定向合成的结构甘油酯，因在特定位置上携带特定的脂肪酸，其氧化性、碘值、黏度和皂化值等物理化学性质发生变化，具有更多营养价值和功能，可以降胆固醇，改善免疫功能，防止血栓形成，减少蛋白质分解，改善其他脂肪吸收，减少热量，保护网状内皮系统，改善氮平衡，降低癌症风险，预防心脑血管疾病[1]等，扩大了甘油酯的应用范围。例如，含有大量中链脂肪酸的甘油酯能有效抑菌、促进肠道有益菌繁殖；含有中长链脂肪酸的结构甘油酯既补充人体所需脂肪酸，又抑制人体脂肪的积累。研究已经证明共轭亚油酸甘油酯能有效降低高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝大鼠的体重，降低血脂，同时减轻高脂饮食引起的非酒精性脂肪肝损伤[2]。而天然甘油酯存在的弊端还有多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFA)含量低且分布随机，导致进入人体后胰脂酶水解能力低，吸收差，而甘油骨架Sn-2位结合PUFA的结构甘油酯就可被有效吸收, 从而提高脑细胞的活性，增强记忆力和思维能力。结合在甘油骨架Sn-2位的棕榈酸含量60%～70%的结构甘油酯可以最大限度地促进婴幼儿对矿物质与脂肪的吸收[3]，已经作为母乳的替代品被广泛使用。因此，结构甘油酯的合成成为近年来的研究热点。结构甘油酯的合成方法主要有化学催化法和酶催化法。本文总结了结构甘油酯的合成方法与研究进展，以及甘油酯的应用，并提出定向合成结构甘油酯的展望。

1 结构甘油酯的合成方法

结构甘油酯的合成方法有化学催化和酶催化。化学催化法采用无机酸、碱为催化剂，由脂肪酸和甘油进行酯化反应，后续再加入脱水剂而制得结构甘油酯。化学催化法的优点为过程较简单、产率高，缺点为酸、碱会严重腐蚀设备，产生废液与废气，污染环境[4]。酶法催化主要采用脂肪酶催化甘油酯进行脂肪酸组成和位置的改变，合成结构甘油酯，其优点有(1)脂肪酶具有底物选择性和产物特异性，以原子经济最大化的方式定向合成特定结构的甘油酯，产物特异性好，产量高，副产物含量低。(2)脂肪酶催化工艺绿色环保，而且以固定化脂肪酶做催化剂可以回收，具有可重复利用的优点，因此适合大规模发展。(3)脂肪酶催化过程中温度、pH等条件温和，可有效减少敏感型底物损失，避免了化学催化过程中反应不稳定、产物氧化、成品率底的缺点。结构甘油酯的定向合成是化学催化法和酶催化法的目标。因此开发化学和生物催化剂、研究其工艺路线成为近年来的研究热点。

1.1 结构甘油酯的化学法合成

1.1.1 甘油单酯的合成

甘油单酯是甘油上只有一个羟基与酸发生酯化反应。目前化学合成甘油单酯主要集中在单硬脂酸甘油酯的研究。单硬脂酸甘油酯的脂肪酰基具有亲脂性，两个羟基具有亲水性。因此有显著的两亲性，可稳定乳液，是食品和化妆品行业中最重要的乳化剂，也常作为制药行业中药物递送系统的纳米脂质体成分[5]。早期化学法合成甘油单酯使用无机化学催化剂[例如硫酸/磺酸/氮气环境下的NaOH/KOH/Ca(OH)2]在高温(220～250 ℃)条件下合成制备甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯的混合物，再通过短程蒸馏的方式获得高纯度的甘油单酯[6]。但是该工艺所得产品的颜色深，甚至出现烧焦的现象，不利于该甘油单酯的应用。目前主流的甘油单酯的合成方法为缩水甘油法和基团保护法。使用缩水甘油与硬脂酸在碱性催化条件下进行酯化制备纯度达90%的单硬脂酸甘油酯。但由于缩水甘油价格昂贵, 限制了该工艺的工业化生产，因此采用含有75%粗甘油的生物柴油副产物替代纯甘油合成单硬脂酸甘油酯，产率可以达到97.97%[7]。采用基团保护法合成单硬脂酸甘油酯，且不含甘油二酯和三酯等副产物。吕成学等[8]利用对甲苯磺酸为催化剂，丙酮为基团保护剂，三氯甲烷为带水剂，最终确定了最佳甘油、丙酮、硬脂酸的物质的量比为1.25∶2.5∶1，80 ℃缩合，反应3 h。当催化剂用量为硬脂酸摩尔分数的2.5%，140 ℃酯化，反应4 h单硬脂酸甘油酯产率达到96.42%。整个过程酯化反应结束后要先经过脱保护用减压蒸馏法蒸出三氯甲烷和反应中的丙酮，随后不断加入盐酸搅拌后进行抽滤和真空干燥再水洗、过滤、干燥后得到产品。虽然基团保护法产率较高，但是生产步骤繁琐，造成成本增加。

1.1.2 甘油二酯的合成

甘油二酯是甘油的两个羟基与脂肪酸发生酯化反应，由酯键位置不同可分为1,3、1,2、2,3-甘油二酯。虽然甘油二酯在食品中含量甚微，但它在脂肪代谢中发挥着重要作用。研究证明1,3-甘油二酯可以降低人体的脂肪积累，防止体重增加[1]。韩丽娟等[9]将3-氯甘油与醋酸钠反应生成3-醋酸甘油单酯,在碱性催化剂催化下与脂肪酸发生酯化反应得到1,2-二脂肪酰-3-醋酸甘油酯, 后在甲醇溶液中与K2CO3进行反应,得到1,2-甘油二酯的总收率达75%以上。PASINETTIG等[10]以1,3-二羟基丙酮与脂肪酸合成1,3-二甘油酯丙酮，再通过硼氢化钠对2位羰基进行还原，最终得到1,3-甘油二酯。而LI等[11]从丙酮缩甘油出发，与酰氯反应首先制备两端羟基被保护的甘油单酯。甘油单酯在酸性条件下脱保护后，与酰氯反应制备1,3-甘油二酯。这种先缩合再还原的方法可以高效制备1,3-甘油二酯，而且可以制备1,3位不对称的甘油二酯。

1.1.3 甘油三酯的合成

化学法合成甘油三酯主要利用浓硫酸催化甘油和乙酸/丁酸生产三醋酸甘油酯和三丁酸甘油酯。以上两者都是无臭的油状液体，前者主要用于香烟过滤嘴增塑剂、酯酶底物测定、固定香料、化学溶剂、气相色谱固定液等，后者主要用于饲料添加剂，例如用于解决家畜的断奶应激综合症，从而提高家畜生产性能，以及降低家畜死亡率。由于浓硫酸的危险性，近年来开发离子液体等毒性小、酸碱性可调、催化效率高的催化剂，可有效避免使用浓硫酸作为催化剂的严重腐蚀设备、后处理复杂和污染严重的缺点。例如，白漫等[12]用离子液体正丙基磺酸-三乙基对甲苯磺酸铵作为催化剂，在甘油∶醋酸∶离子液体比例为1.0∶4.0∶0.1时的三醋酸甘油酯得率高达96%。蔡志锋等[13]将离子液体[(n-Bu-SO3H)MIm][HSO4] 与纳米二氧化硅载体混合，制备成负载型离子液体催化剂BHS([(n-Bu-SO3H)MIm][HSO4][SiO2])，其甘油转化率为97.2%。Brønsted-Lewis酸性离子液体是一种不错的选择。LIU等[14]采用此酸性离子液体在4 h反应后得到高于98%的三醋酸甘油酯得率。而且，经过6个循环后的三醋酸甘油酯得率不降低。离子液体做催化剂的不足在于反应后离子液体与产物混为一相，分离困难。LIU等[15]合成了微/介孔结构的分子筛催化剂HZSM-5/MCM-41，其甘油转化率达到100%，甘油三醋酸酯的得率超过91%，且更易产物分离。周志刚等[16]采用传统方法有机碱三乙胺为缚酸剂，使甘油和丁酰氯在三氯甲烷中发生反应，三丁酸甘油酯得率达83.76%。徐国华等[17]针对氯酰腐蚀性强，不易运输，且遇空气产酸雾等缺点，使用发烟硫酸作为催化剂将丁酸与甘油在无溶剂条件下反应，最终三丁酸甘油酯的得率高于98%。该法操作简单，产物不用洗涤，减少了废水和废气的排放。

1.2 酶法合成结构甘油酯

结构甘油酯的酶法合成采用脂肪酶(EC 3.1.1.3)的特异性将特定脂肪酸结合到甘油的特定羟基，产生结构甘油酯。脂肪酶被广泛用于生物柴油和清洁剂生产，在生物修复、化妆品、皮革和造纸等领域也被广泛应用。为了适应多样化的原料和结构甘油酯产物的需求，开发不同底物特异性、产物特异性的脂肪酶就成为研究热点。目前开发特异性脂肪酶的方式主要通过改造已有脂肪酶，有理性设计、非理性设计、半理性设计3种方法。理性设计基于对脂肪酶的结构与功能之间关系，找出相关残基或者结构区域，再进行基因工程改造得到理想的脂肪酶。该方法的优势在于避免了大量筛选工作，但是难点在于突变位点的精准选择会出现潜在位点遗漏的现象。非理性设计不考虑酶结构信息，进行随机突变后再进行高通量筛选。半理性设计综合以上2种方法，提高了成功率且不需要大量筛选。因此对于酶的理性设计和半理性设计成为近年来研究趋势和热点。例如，米根霉脂肪酶因其优异的Sn-1,3区域选择性而很重要，但其热稳定性差，严重限制了其应用。ZHAO等[18]通过对其进行理性设计，找到影响酶热稳定性的位点并预测，在第190～238位引入二硫键，大大提高了蛋白质的热稳定性。突变体E190C/E238C在55 ℃孵育720 min后仍保持58.2%活性，而野生型的半衰期仅为11.7 min。进一步构建四重突变体V209L/D262G/E190C/E238C的半衰期分别是野生型脂肪酶半衰期的102.5倍。LAN等[19]从米曲霉中分离出一种特殊的水解甘油单酯和甘油二酯的脂肪酶，通过序列比对发现269位较重要并进行设计突变，V269D对1,3-甘油二酯的水解活性提高到约6倍，其酯化活性增加了2.6倍。

根据合成结构甘油酯的类型，脂肪酶的分类如图1所示。除结构甘油酯中脂肪酸的数量、位置，还可以根据底物不同、脂肪酸的链长分为短链甘油酯(short-chain triacylglycerols，SCT)、中链甘油酯(medium-chain triacylglycerols，MCT)、中长链甘油酯(medium and long-chain triacylglycerols，MLCT)、长链甘油酯(long-chain triacylglycerols，LCT)、长短链甘油酯(short and long-chain triacylglycerols，SLCT)等。

图1 脂肪酶特异性催化分类
Fig.1 Classification of lipase according to its specificity

目前已发现多种来源的脂肪酶[20]。表1总结了目前已发现的脂肪酶的位置选择性、催化三联体、结构信息。由表1可知，目前发现的脂肪酶的位置选择性主要为1,3位，底物主要为中长链脂肪酸。因此，合成特定脂肪酸组分、特定甘油羟基位点的脂肪酶是合成结构甘油酯的2个重要方向。

表1 脂肪酶的特异性及结构信息
Table 1 Specificity and structural information of lipase

续表1

1.2.1 合成含有特定脂肪酸的甘油酯

根据脂肪酶的底物链长特异性，可以合成特定链长脂肪酸甘油酯。研究者初始采用脂肪酶筛选、固定化载体筛选的方式得到结构甘油酯。将具有中链脂肪酸偏好性的YLL脂肪酶固定在Accurel MP 1000树脂上后，在无溶剂条件下催化橄榄油、辛酸(C8∶0)、癸酸(C10∶0)和甘油发生反应得到辛酸占25.6%、癸酸占21.3%的甘油酯[37]。IFEDUBA等[38]优化了固定化RML脂肪酶的载体后，使辛酸、硬脂酸(C18∶0)与大豆油发生反应得到含有辛酸32.5%、硬脂酸42.3%的结构甘油酯。甘油酯的长链脂肪酸为ω-3不饱和脂肪酸，例如二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)、二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)时具有软化血管、健脑益智、改善视力的功效多不饱和脂肪酸的功能。目前4种商业脂酶NS40086、Novozym 435、Lipozyme RM IM和Lipozyme TL IM中Lipozyme RM IM较适合生产富含DHA的长链甘油酯，得率为44.70%，且Sn-2位含量为69.77%的结构甘油酯[39]。Lipozyme AOAB8(来自米曲霉)在无溶剂体系催化也有相似的效果，产物中含有30.91%月桂酸和44.68%DHA 的结构甘油酯，并且该酶可重复使用至少9次[40]。但是天然脂肪酶还不能满足底物特异性的所有需求，所以，对脂肪酶进行改造就成为必然选择。例如，CRL脂肪酶LIP2底物结合口袋中L132突变后得到中长链脂肪酸特异性更显著的突变体L132A和L132I。这是因为亮氨酸和丙氨酸的疏水性和较小的侧链导致更大的结合腔体与中长链脂肪酸结合。突变成异亮氨酸后由于侧链增加了甲基和乙基基团而增强了亲和力[41]。对华根霉(Rhizopus chinensis)脂肪酶进行理性设计，在结合口袋氨基酸H284和L285中间插入一个亲水性的谷氨酰胺，改变其亲、疏水性以及侧链基团大小后，对长链底物水解活力提高了2.72倍[42]。ZHAO等[43]将脂肪酶MAS1的关键位点替换为丙氨酸(H108A、F153A)以增强催化口袋的疏水性和底物结合腔，使脂肪酸催化C8的kcat/Km分别提高2.3、2.1倍；催化C16的kcat/Km分别提高3.0、2.2倍；催化C16的kcat/Km分别提高3.0、2.2倍。脂肪酶MAS1的苯丙氨酸被取代后减少脂肪酶表面张力，稳定了酶结构。因此，基于亲、疏水性、结合口袋对脂肪酶进行理性设计改造可以显著提高底物特异性。

1.2.2 合成特定位置脂肪酸的结构甘油酯

另一方面，脂肪酶的位置选择性也是合成特定结构甘油酯的重要方面。例如，人乳脂肪替代品的结构甘油酯1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油酯(1,3-dioleoyl-2-palmitoylglycerol，OPO)、1-油酸-2-棕榈酸-3-亚油酸 (1-oleoyl-2-palmitoyl-3-linoleylglycerol，OPL)都对位置选择性有较高的要求。ROBLES等[44]在无溶剂条件下比较了固定在Accurel MP1000的ROL脂肪酶、Lipozyme RM IM、Lipozyme TL IM以富含棕榈酸(palmitic acid，PA)甘油酯(74.5% Sn-2位为PA)和富含油酸(Oleic acid，OA)的游离脂肪酸为底物合成结构甘油酯，结果表明固定化ROL脂肪酶对油酸在Sn-1,3掺入能力强，获得Sn-1,3位油酸67.2%, Sn-2位棕榈酸67.8%的结构甘油酯。高亮等[45]利用 Lipozyme RM IM催化得到Sn-2位棕榈酸占比高达84.70%的结构甘油酯。ZHENG等[46]将筛选的解脂假丝酵母(Candida lipolytica)脂肪酶固定在磁性多壁碳纳米管上，使产物中OPO含量达46.5%，明显优于固定化酶Lipozyme RM IM 和Lipozyme TL IM。针对在甘油Sn-1,3位置为中链脂肪酸和在Sn-2位置为长链不饱和脂肪酸的结构甘油酯可有效预防和/或治疗与肥胖相关的代谢和炎症紊乱，许多科研人员对合成该类型结构甘油酯进行研究。AKIL等[47]选择TLL脂肪酶在无溶剂条件下中以癸酸(C10∶0)、月桂酸(C12∶0)和三油酸甘油酯反应后，癸酸和月桂酸的掺入Sn-1,3的效率高达30%。由于破囊壶菌油含有丰富的DHA，采用破囊壶菌油与辛酸在正己烷环境下进行反应，产物中辛酸40.8%(Sn-1,3位占的91.2%)，Sn-2位的DHA 45.5%[48]。

理性设计已经在结构甘油酯特定位置结合脂肪酸方面展示了强有力的效果。喻晓蔚等[49]通过理性设计对华根霉脂肪酶第8位甲硫氨酸、第9位的苏氨酸、第10位亮氨酸替换成丙氨酸，发现其Sn-1,3位置专一性指数分别从野生型的20提升到100、95、99。赵泽鑫[50]发现脂肪酶MAS1的N45、H108、T237等位点参与脂肪酶的位置选择性的调控，通过增加脂肪酶MAS1中残基与以 Sn-2位反应模式进入口袋的极性部分(即甘油骨架)的静电相互作用、避免不参与反应羰基的结合位点附近存在带负电基团的残基、提高脂肪酶MAS1的构象稳定性，提高其 Sn-2位反应活性；相反，引入大侧链残基来封闭以Sn-2位反应模式可以增加Sn-1,3位反应活性。

2 结构甘油酯在食品等相关领域的应用

2.1 食品领域应用

2.1.1 母乳脂肪替代品

母乳脂肪中富含必需脂肪酸和脂溶性维生素，同时为婴儿提供了50%的能量，对婴儿的生长发育至关重要。例如，结构甘油酯1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油酯、1-油酸-2-棕榈酸-3-亚油酸等因其脂肪酸分布与母乳相似，棕榈酸主要在Sn-2位，而Sn-1,3位主要由不饱和脂肪酸[3]。该结构甘油酯由于独特的脂肪酸分布还具有改善脂肪与矿物质的吸收、减少便秘等功能，可以有效替代母乳，减轻母亲的压力。

2.1.2 类可可脂

类可可脂 (cocoa butter equivalents, CBEs) 与天然可可脂具有相似的物化性质，可有效缓解由于天然可可脂的高生产成本和原料缺乏带来的限制。CBEs主要成分为1,3-二棕榈酸-2-油酸甘油酯(POP，15%～19%)、1-棕榈酸-2-油酸-3-硬脂酸甘油酯(POS，36%～41%)和1,3-二硬脂酸-2-油酸甘油酯(SOS，25%～31%)，可由低成本植物油生产[3]。

2.1.3 低热量脂质

人体肥胖的主要原因是过多摄入油脂。而低热量脂质和普通油脂的物化性质和口感相同，其热量(4.5～6 kcal/g)要比普通油脂热量(9 kcal/g)低,且具有降低胆固醇、降血脂的功效。低热量脂质主要由短长链甘油三酯组成[3]，目前比较成熟的商用短长链甘油酯产品是Salatrim系列，该酯进入人体后较低的吸收会在小肠内部留下未消化的脂肪酸，由于胆囊收缩素、胰高血糖素肽-1等调节食欲的胃肠激素作用产生更大的饱腹感[51]。该酯已经广泛用于食品加工领域生产低热量产品，例如可制成一系列低热量糖果，如焦糖、太妃糖、奶糖等。这些产品比用高热量脂肪制成的糖果能量降低了约45%。

2.1.4 低反式/零反式脂肪

天然的油料作物加工成食用油时，高温加热会产生反式脂肪酸，市面上的人造黄油与起酥油中也含有大量反式脂肪酸，而摄入大量反式脂肪酸对心血管健康有不利影响，增加冠心病的发病风险。还会导致肥胖、血栓、阿尔兹海默病等疾病。中短链饱和脂肪酸会被快速消化，转化成能量消耗掉，促进新陈代谢，达到减肥的效果[3]。表2列出了目前广泛应用于食品领域的结构甘油酯成分组成及其功能。

表2 常见结构甘油酯的脂肪酸组成以及功能应用
Table 2 Fatty acid composition and functional application of common structural glycerides

2.1.5 防腐剂、乳化剂

甘油单酯是一类重要的非离子型表面活性剂，含有一个亲油的长链烷基和两个亲水的羟基，具有优良的表面活性，可作为乳化剂进行应用。部分甘油单酯具有一定的抗菌特性，例如月桂酸甘油单酯，具有广谱抗菌性，而且安全性高、性能稳定，同时表面活性也较强，已经在多个国家实现工业化生产，并作为食品防腐剂投放市场。

2.2 其他应用

2.2.1 脂肪乳剂

脂肪乳剂可用于肝功能、肾功能不全及体弱婴幼儿的肠外营养。而传统乳剂因原料大豆油中多不饱和脂肪酸过多在吸收过程中会对免疫功能造成损伤，而且容易过氧化。中长链甘油酯为原料的脂肪乳剂可安全有效地为术后病人提供能量，使用过程中更加稳定，减少氧化带来的危险。携带ω-3脂肪酸的脂肪乳剂具有抗炎与免疫调节作用，ω-3鱼油脂肪乳剂能对环氧化酶产生竞争性抑制作用，从而抑制炎性因子生成。此外对T细胞膜脂肪酸组成产生影响，进而影响IL信号传导，同时还可增大细胞膜流动性[53]。

2.2.2 药物载体辅剂

长链甘油酯，例如山萮酸甘油酯，拥有高熔点、两亲性、固体粉末形式，更易引入制剂，具有良好的性能。例如山萮酸甘油酯商业化产品Compritol，与其他润滑剂相比，其惰性更好，更低的剪切力，对混合时间不敏感。由于具有良好的熔融与流变特性，该产品可作为亲脂性黏合剂用于制备微丸[54]。作为载体材料对药物有更高的相容性和包封效果。

2.2.3 饲料

中链甘油酯(己酸、辛酸、癸酸、月桂酸)被人体摄入后以通过血液运输快速到达肝脏和肠胃，不参与外周循环，从而实现高能量的快速供应且易吸收，在家禽、家畜饲养中被广泛应用。此外中链甘油酯可以提高动物机体的淋巴细胞增值速度，增强对白细胞介素的表达，实现免疫调节。中链甘油酯因高能量特点，还具有对肠道菌群起到促进繁殖的作用，达到肠道调节的目的。研究证明饲料中添加了中链甘油三酯，使仔猪饲料转化率提高7%，日增重提高5%[55]。

3 展望

虽然结构甘油酯在食品工业方面具有光明前景，但是目前存在合成的甘油酯种类过少、传统化学法特异性不足及合成过程不够绿色环保等问题。利用酶法合成结构甘油酯则可有效避免上述问题。而且，随着生物信息学、结构生物学、量子化学等学科的发展，以及固定化、微囊化等技术的逐步成熟，对酶进行修饰和突变，提高酶催化的特异性、热稳定性已取得较大进展。虽然对于结构甘油酯的合成充满前景，但仍需要从以下2个方面进行突破：(1)建立合成结构甘油酯数据库。数据库包含化学法催化剂及达到最高含量甘油酯的催化过程的最适条件，以及催化所用离子液体的合成方法等；酶法催化中所用酶的品种、酶载体、突变策略、突变位点、突变效果等。这将为相关研究提供参考作用，有利于研究更加具有目的性。(2)多学科融合到生物催化研究。通过量子化学、生物信息学、结构生物学、计算生物学等手段实现对酶的精确改造，对酶的催化机理进行深层次的认知。通过多学科参与酶的改造，使定向合成甘油酯不再盲目。以上措施将促进酶催化法的研究，极大提高结构甘油酯的合成效率和种类，达到绿色食品工业过程的目标，扩大结构甘油酯在食品领域的应用。