脂肪酶在面包和馒头中应用研究进展

馒头是深受中国人民喜爱的传统主食之一。由于环境温度、制作条件以及原粮小麦品质的不稳定性等因素的影响，馒头的品质很难得到保证。在馒头工业化生产中，经常出现表皮龟裂、有气泡；颜色发暗、发黄；内部结构不均匀或有大孔洞等问题。因此，为了改善和提高馒头品质，在原料面粉或馒头制备过程中需添加各种添加剂，如乳化剂[1]、碱[2]、酶制剂[3]和增白剂[4]等。

随着科技的发展和人们安全意识的提高，馒头中添加剂的使用要求越来越严格，运用新型酶制剂来改善面制品品质成为国内外研究的热点之一。酶制剂中的脂肪酶作为一种生物制品，应用在面包和馒头品质的改良中，具有显著的优越性：脂肪酶本身就是活细胞产生的活性蛋白质，不会留下有毒物质；脂肪酶的催化作用具有高度的专一性，而且操作条件温和。小麦粉中脂质的种类是影响脂肪酶作用效果的关键，然而不同脂肪酶的作用底物和水解产物不同，对馒头品质的影响也不同。

本文对面粉中内源性脂的种类及其功能效应、脂肪酶的催化机制及其在发酵面制品中作用底物、脂肪酶对面包和馒头等发酵制品品质的影响进行了阐述，并展望了脂肪酶在馒头和面包中应用的未来研究趋势。

1 面粉中内源性脂的种类及其功能效应

面粉中内源性脂质的种类及含量影响馒头、面包等发酵制品的品质[5-6]。特别是面粉中的极性脂，这类脂有助于提高面筋网络结构中的气室稳定性，从而使得面包体积有所增加。而且脂质与脂质之间还存在不同的功能效应，对发酵制品的品质产生不同的影响。

1.1 面粉中脂质的种类

面粉中内源性脂质的含量约为2.0%～2.5%[7-8]，按化学结构可分为非极性脂(或中性脂)和极性脂(主要是糖脂和磷脂)[7,9]。常见的几种面粉脂如图1所示。甘油三酯(triacylglycerol, TAG)和游离脂肪酸(free fatty acids, FFA)的含量最丰富，甘油糖脂和甘油磷脂(也可称为糖脂和磷脂)是面粉中主要的极性脂，糖脂主要有单半乳糖甘油二酯(monogalatosyl diglyceride, MGDG)和双半乳糖甘油二酯(digalactosyl diglyceride, DGDG)，磷脂类包括N-酰基磷脂酰乙醇胺(N-acyl phosphatidyl ethanolamine, NAPE)、磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine, PE)、磷脂酰胆碱(phosphatidyl choline, PC)、磷脂酰丝氨酸(phosphatidyl serine, PS)及各自的溶血磷脂(phosphatidyl inositol, PI)等[10-11]。

1.2 内源性脂质的功能效应

SCHAFFARCZYK等[5]研究表明DGDG是天然面粉类脂类中主要的半乳脂类，随着双半乳糖单酸甘油酯(digalactosyl monoglycerides, DGMG)浓度的增加和DGDG浓度的降低，面包体积显著降低，因为DGDG的功能效应比DGMG的要高得多。但是，当DGDG和DGMG的摩尔比为1∶1时，可以显著增大面包的体积，这说明DGDG和DGMG存在协同效应，脂类之间的协同作用可以增强气室界面的稳定[12]。GERITS等[13]研究结果显示面团中的脂质相互作用是将不利气室稳定的非极性脂质乳化为油滴，比如DGMG促进了六方相Ⅰ脂类的形成，即DGMG可能有助于去除界面上的有害脂质，从而支持界面处DGDG的功能效应。另一种可能性是脂类形成不同类型的结晶相，如六方相Ⅱ，含有这些脂类混合物的单分子层具有与层状结构的脂质组成的单分子层相似的稳定性。由于协同效应而产生的脂质相互作用也可以减少脂质体或胶束的能量屏障，通过形成不同的脂质类型的混合胶束吸附到界面上，增加界面活性物质的有效性[12]。除此之外，N-酰基溶血磷脂乙醇胺(N-acyl lysophosphatidyl ethanolamine,NALPE)也是形成层状中间相而改善面包体积[13]。

图1 小麦粉中常见的脂质结构式
Fig.1 General structures of common lipids in wheat flour

脂质除了与脂质之间具有功能效应外，脂质与蛋白、淀粉之间也有一定的功能效应。PAREYT等[7]研究表明FFA和面筋蛋白之间没有相互作用，可能FFA的疏水烷基链限制了它们之间的相互作用。因此，FFA并不能促进蛋白质颗粒的聚集，也不能使其产生更强的面筋网络结构。然而，SROAN等[14]研究表明超过临界浓度(在天然存在的浓度范围内)，小麦粉中的游离极性脂质可以通过稳定液体层来改善产品体积，该液体层可分离面团中的气体；非极性的脂质可能会破坏气室，不饱和的FFA会使得体积降低，而饱和的FFA则不会[15]。PAREYT等[7]研究发现面团发酵前脂质结晶体的排列是杂乱无章的，发酵后的脂质结晶体整齐的排列在蛋白质界面上，在焙烤过程中，脂质结晶体变成油滴。在面团形成过程中脂质重新分配到面筋网络中，面筋蛋白是带正电的(pH=6)，内源性极性脂质和表面活性剂带负电，如双乙酰酒石酸单双甘油酯(N-acyl lysophosphatidyl ethanolamine, DATEM)和硬脂酰乳酸钠(sodium stearyl lactate,SSL)，它们通过静电作用和疏水相互作用与蛋白质结合，从而促进了面筋的形成，因为静电斥力减少，这本身就增加了面筋网络的强度[16]。在面包制作中，自由脂和结合脂的功能明显不同，极性的自由脂比结合脂更有益。还有些学者证明半乳糖脂通过疏水作用和氢键与麦谷蛋白相互作用，而磷脂与麦醇溶蛋白或面筋的脂结合蛋白相互作用[7]。COURTIN等[17]研究发现小麦粉中的一些脂类具有类似表面活性剂的功能，在面包焙烤过程中会与直链淀粉形成复合物，可对面包瓤的组织结构具有软化的作用，延缓面包的老化。

MACRITCHIE等[18]研究发现与面粉中任何其他成分的变化相比，改变自由脂含量对面包的体积和质地影响更大。MORRISON等[19]发现在小麦5D染色体上的2个位点(Fpl-1和Fpl-2)控制着自由脂中DGDG和MGDG的含量。然而，这些位点对结合脂中极性脂质的含量几乎没有影响，在小麦育种方案中可以改变游离的极性脂质含量来提高小麦面粉的质量。

2 脂肪酶的催化机制及其在发酵面制品中作用底物

脂肪酶(lipase E.C.3.1.1.3)也称酰基甘油水解酶，是一类在油-水界面上催化天然油脂(甘油三酯)降解为甘油和游离脂肪酸的酶。脂肪酶是一类水解酶，广泛存在于细菌、霉菌、酵母等微生物及其他一些动植物中，微生物源脂肪酶具有更大的应用前景[20-21]。界面酶学与非水酶学的突破性发展，极大地促进了脂肪酶多功能催化作用的研究。

2.1 脂肪酶的催化机制

大多数微生物脂肪酶都属于α/β水解酶，其活性位点是由Ser、His和Asp残基组成的催化三联体[22]，在其周围还存在Gly-X-Ser-X-Gly组成的五肽结构。脂肪酶具有1个α螺旋形成的“盖子”结构(图2)，“盖子”的外表面相对亲水，而内表面则相对疏水，该结构不仅影响酶活性，而且影响酶对底物的特异性和稳定性。

图2 脂肪酶发生催化作用前后的结构
Fig.2 Structure of lipase before and after catalysis

当脂肪酶与油-水界面相接触时，覆盖活性位点的α螺旋打开，暴露疏水残基，增加与脂类底物的亲和力，同时该变化导致脂肪酶在Ser周围产生亲电区域，可保持催化过程中过渡中间产物稳定，使脂肪酶处于活化构象[23]。脂肪酶的催化机制可以分为4步：首先是底物与酶结合，即形成共价结合的底物-酶复合物，然后是快速脱酰，从而激活丝氨酸的羟基，进而攻击羰基部分，产生四面体中间体，使得前一羰基的氧上带负电荷，再形成稳定的共价中间体复合物，最后是酰基化合物的释放。

2.2 脂肪酶在面制品体系中作用底物解析

脂肪酶在面制品体系中可能的作用底物主要有非极性脂TAG以及极性脂糖脂和磷脂，可能的作用位点见图3。脂肪酶水解TAG时，作用于TAG的酯键，水解产生甘油二酯(diacylglycerol，DAG)和FFA，还可进一步水解DAG和甘油一酯(monoglyceride,MAG)中的酯键，产生FFA[24](图3-a)。在水解过程中，不同的面粉脂类含量不同，脂肪酶产生的DAG、MAG、甘油和FFA的种类及比例不同，可能会对面制品的品质影响不同。

a-1, 2, 3为脂肪酶作用于TAG的位点； b-1, 2, 3, 4为脂肪酶作用于磷脂的位点； c-1,2为脂肪酶作用于糖酯(半乳糖脂)的位点
图3 脂肪酶作用位点
Fig.3 Sites of potential hydrolysis

脂肪酶水解磷脂时，催化磷脂的一个或多个酯键以及磷酸二酯键水解[25]。不同的脂肪酶可水解磷脂的部位不同，有的脂肪酶水解sn-1上的酯键生成FFA和溶血磷脂；有的脂肪酶水解sn-2上的酯键，产物为溶血磷脂、FFA和甘油磷脂酰胆碱或甘油磷脂酰乙醇胺；有的脂肪酶可水解甘油磷酸二酯键，生成甘二酯等；有的脂肪酶可去除极性基团，但不能去除磷酸基团[26](图3-b)。不同的脂肪酶产生的溶血磷脂、FFA、甘油磷脂酰胆碱或甘油磷脂酰乙醇胺等产物的种类和比例不同，也会导致对面制品的品质影响不同。

脂肪酶水解糖脂时，可完全水解糖脂生成1个或所有FFA和其他极性脂类(图3-c)。因此，不同的面粉中糖酯含量不同，也可能导致脂肪酶水解产生FFA和其他极性脂类种类和比例不同，从而也可能会导致对面制品的品质影响不同。

脂肪酶具有专一性，不同的脂肪酶具有不同的作用底物，甚至是不同的作用位点。在不同的面粉中，脂类含量不同以及脂类中极性脂、非极性脂的种类和比例不同，都会导致脂肪酶作用产物不同，从而导致不同脂肪酶对同一种小麦面粉制作的馒头品质改良效果不一样，同一脂肪酶对不同面粉制作的馒头品质改良效果也不一样。

3 脂肪酶对面包和馒头等发酵制品品质的影响

随着生物技术的不断发展，运用新型酶制剂来改善谷物制品品质成为国内外关注的热点[27]。脂肪酶作为一种安全、高效、纯天然绿色添加剂，被广泛应用于馒头、面包等发酵制品加工中。脂肪酶作用于小麦粉中的内源性脂质，产生表面活性剂分子，如溶血磷脂和单甘酯等[28]，来提高产品的质量。

3.1 脂肪酶对面包品质的影响

1990年脂肪酶就开始应用于焙烤行业，以改善面团的加工品质[29-30]。王雨生等[31]研究表明脂肪酶能有效改善面包粉流变品质，改善面包的硬度和弹性。王学东等[32]研究表明面包粉中适量添加脂肪酶，可显著改善面包粉的拉伸特性、提高面包品质。在面包中添加脂肪酶后，面包的光泽度和白度得到明显改善[5,12,16,33]，面包的比容增加，同时提高了面包的松软度，使面包瓤的孔隙度更加均匀[34]。JANSSEN等[35]研究表明添加Lipopan.F增加了面团中的极性脂质水平，对面团中气泡稳定具有积极的影响，增加面包的体积。GERITS等[13]研究发现脂肪酶Lipopan F、Lecitase Ultra对面包的影响与表面活性剂一致，均增加了面包体积，脂肪酶对脂质的作用使得面包体积增加了56%，这取决于添加脂肪酶的种类和浓度。

SCHAFFARCZYK等[12]研究了脂肪酶Lipopan.F BG和Lipopan.Xtra BG对面包品质的影响。研究发现这2种脂肪酶对面包的质构和体积均有不同程度的改善作用，而且相同剂量下，Lipopan.F BG对面包体积的改善作用要优于Lipopan.Xtra BG，另外，这2种酶并不是剂量越大对面包体积的改善就越好，两者均有一个最佳添加量；采用分离重组技术证明了在面包制备过程中，这2种酶更多的作用于面粉中极性脂，从而产生较多的极性脂产物，对面包品质起到改善作用[5,36]。适量极性脂会增加面包中气室的稳定性，增大面包体积[7,13-14,24,37]。极性脂可与面筋蛋白、淀粉结合形成复合物，并能促进蛋白质聚集，使面团形成更好的网络结构[16,36]，从而改善面包的质构。但是，以上研究对于起主要作用的极性脂的种类及其作用机理并未涉及。另外，脂肪酶在一定条件下能够将脂类水解成单甘脂，而单甘酯在淀粉糊化过程中与淀粉分子络合，提高糊化温度，抑制了淀粉颗粒的膨胀，减弱了淀粉颗粒与面筋蛋白之间的相互作用，也可延缓支链淀粉的回生。脂肪酶水解脂质经过一系列反应产生过氧化物，可氧化蛋白质分子中的硫氢基团，形成分子内或分子间二硫键，并能诱导蛋白质分子聚合，使蛋白质分子变得更大，从而提高面团筋力，改善面包的质构[16,38]。脂肪酶可以改变面包瓤的结构，使气孔分布小而均匀，其反射效果更佳，提高亮度，从而达到增白的效果[39]。

3.2 脂肪酶对馒头品质的影响

目前脂肪酶应用于馒头品质的改良报道较少，对改良机理的研究尚未见报到。张磊等[40]研究了丹麦Novozymes脂肪酶、荷兰DSM脂肪酶和国产Sunson 脂肪酶3种脂肪酶对馒头品质的影响，研究表明适量的3种酶可提高面筋强度，延长稳定时间，降低弱化度，增加面团延伸度和拉伸阻力，改善面团的流变学特性。对馒头的比容、色泽、结构和弹韧性等均有一定的改善作用。而且脂肪酶添加量并不是越大越好，过量添加反而会对馒头造成负面影响。并推测脂肪酶对馒头的体积、内部结构等有改善作用是因为脂肪酶酶解面团中的油脂成分生成天然的单甘脂等乳化成分；对馒头白度改善是因为在脂肪酶的作用下，原来溶于脂肪中的叶黄素和叶红素被释放出来，与空气接触，色素被氧化褪色。杜洋等[41]研究了脂肪酶(酶活性4 000 U/g)对馒头外观品质的影响。研究发现所用脂肪酶对pH和温度条件敏感，在适宜条件下，其较高的活性有利于改善馒头的形态和颜色，并优化出脂肪酶增白馒头的最适工艺条件。李守宏等[42]研究了几种单一酶制剂在馒头中增白的应用和复配使用的效果及新型脂肪酶 Lipopan.Prime在馒头增白和组织改善中的应用。研究发现Lipopan.Prime能够提供良好的白度、体积和组织，对面团的稳定性也有积极的作用。并指出传统脂肪酶的增白效果虽然好，但会破坏馒头的组织结构。脂肪酶的水解作用决定了其对馒头品质的影响。而方晓波[43]研究发现脂肪酶对馒头比容的影响不显著，脂肪酶的作用效果取决于面粉中的内源性脂，添加脂肪酶会使这些内源性脂质的活性得到改善[44-45]。

综上可知，不同脂肪酶对同一种面粉制作的馒头品质改良效果不一样，同一脂肪酶对不同面粉制作的馒头品质改良效果也不一样。推测原因可能是不同的面粉中脂类含量不同，以及脂类中极性脂、非极性脂的种类和比例的不同，导致脂肪酶作用底物的不同，从而产生不同种类及比例的水解产物，进而对馒头品质产生不同影响。

4 结语

在面包和馒头制作过程中，脂肪酶是改善产品质量的一种很好的选择。但是由于面团体系的复杂性，脂肪酶与小麦面粉中的脂质之间，以及产物与蛋白质、淀粉分子之间的相互作用机制尚未可知。因此，研究不同脂肪酶对同一种面粉制作的馒头品质改良效果不一样，以及同一脂肪酶对不同面粉制作的馒头品质改良效果也不一样的原因，揭示脂肪酶对面包和馒头的影响机制，将是未来脂肪酶在面包和馒头中应用的研究方向。