间歇热处理对西葫芦冷害及活性氧代谢的影响

西葫芦(Cucurbita pepo L.)又名角瓜，属于葫芦科南瓜属，其适应性强、栽培技术简单，且营养丰富、清脆可口，因此颇受广大消费者喜爱，是我国主要瓜类蔬菜之一[1]。但西葫芦采后生理代谢旺盛，在常温放置易发生表皮褪色、组织松软，甚至腐烂变质，易失去食用与商品价值[2]。目前低温贮藏是果蔬保鲜中应用最广且简单有效的方法[3]。但西葫芦属于冷敏型果实，研究发现7 ℃以下贮藏会发生冷害，造成表面点蚀、果皮褐变、组织塌陷和果皮表面凹陷[1]。因此，如何控制西葫芦在采后贮藏中冷害的发生具有重要的研究意义。

热处理作为一种安全而环保的物理保鲜技术，在减缓西红柿[4]、黄瓜[5]、桃子[6]等果蔬的采后腐烂、提高冷藏过程中果实的抗冷性及控制采后生理紊乱等方面效果显著。但连续热处理的温度过高或时间过长，果蔬的热应力会继续增加和积累，可能会造成热损伤，出现果皮变色和抗氧化能力降低等[7]。而间歇热处理不仅可以中断热应力的连续积累，减少热伤害，还有助于应激效应的产生和积累[8]。ZHANG等[9]研究发现间歇热处理能够减少黄瓜的热伤害，可以更好地保持黄瓜的感官品质，具有提高抗氧化酶的活性和减少膜脂过氧化的作用。程玉娇等[10]的研究表明与连续热处理相比，间歇热处理通过维持血橙较高的抗氧化能力达到最佳的保鲜效果。闫凯亚等[8]发现对鲜切甘薯进行间歇热处理后，其抗冷性和保鲜效果均优于连续热处理组。由此推测间歇热处理可能更有利于减轻采后果实的冷害。

果蔬冷害的发生与活性氧代谢失调有关[11]，间歇热处理是否可以通过调节活性氧代谢来减轻西葫芦的冷害还未见报道。因此，本研究以“盛美一号”西葫芦为试材，分别对其进行连续热处理和间歇热处理，测定间歇热处理对西葫芦低温贮藏期间冷害指数、品质指标及酶活性的影响，为冷害研究和间歇热处理技术应用提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验材料为“盛美一号”西葫芦，采购于上海丰伟果蔬合作社，选取大小一致，无病虫害、机械损伤，色泽均匀，单果质量约350 g的果实。

三氯乙酸、硫代巴比妥酸、氢氧化钠、愈创木酚、聚乙烯吡咯烷酮，上海泰坦科技股份有限公司；丙酮、无水乙醇、愈创木酚、30%(体积分数)H2O2、冰醋酸、浓硫酸，国药集团化学试剂有限公司。试验所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

BP301S型电子天平， 德国赛多利斯公司；D37520 Osterode型高速冷冻离心机，德国Biofuge公司；DKS-16恒温水浴锅，艾万拓威达优尔国际贸易(上海)有限公司；WYA-ZT阿贝折光仪，上海仪电物理光学仪器有限公司；CM-5分光测色计，日本柯尼卡美能达；μQuant酶标仪，德国BIO-TEK 公司；TA.XT物性测定质构仪，英国SMS公司；S230电导率仪，深圳市德优平科技有限公司；DW-86L626超低温冰箱，海尔集团。

1.3 试验方法

1.3.1 处理方法

将试验材料随机分成3组，分别进行以下处理：对照组(室温20 ℃清水浸泡10 min)、连续热处理组(40 ℃热水浸泡10 min)、间歇热处理(40 ℃/200 s+20 ℃/10 min+40 ℃/200 s+20 ℃/10 min+40 ℃/200 s+20 ℃/10 min)。每组处理180根，处理后晾干,用0.04 mm聚乙烯袋包装(40 cm×60 cm，湖北武汉共创塑业一站式批发店)，置于温度为(3±1) ℃、相对湿度为80%～85%的冷库中贮藏18 d，每次试验重复3次，每3 d随机取样测定相关指标。

1.3.2 冷害指数的测定

冷害的评定参照张苗等[1]的方法。按西葫芦表皮冷害面积的大小分为5级，评分方案如下：0级：无冷害；1级：0%<冷害面积≤25%；2级：25%<冷害面积≤50%；3级：50%<冷害面积≤75%；4级：75%<冷害面积≤100%。冷害指数计算如公式(1)所示:

冷害指数

(1)

1.3.3 失重率的测定

西葫芦失重率的测定采用称量法。测量第0天的初始重量M0，贮藏固定时间后的质量M1。计算如公式(2)所示：

失重率

(2)

1.3.4 硬度、a*和b*值的测定

西葫芦硬度采用TA.XT质构仪进行测定，选用P/5型探头，测量果实赤道部位的硬度，结果以g表示。

西葫芦a*、b*值采用CM-5分光测色计，测量西葫芦果皮赤道部位的a*、b*值。

1.3.5 可溶性固形物和可溶性蛋白含量的测定

可溶性固形物和可溶性蛋白含量的测定参照曹建康等[12]的方法，其中可溶性固形物含量以%表示，可溶性蛋白含量用mg/g表示。

1.3.6 相对电导率和丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量的测定

相对电导率的测定参照姜雪等[13]的方法并略加修改，用打孔器将西葫芦果皮制成直径为5 mm的组织圆片，取5片圆片于烧杯中并加入40 mL的蒸馏水，用电导率仪测定果实的电导率C0，然后静置30 min 后测定电导率C1，再煮沸5 min，冷却至常温后测定电导率C2。相对电导率计算如公式(3)所示:

相对电导率

(3)

MDA含量的测定参考ZHANG等的方法[14]，采用酶标仪测定，结果以μmol/g表示。

1.3.7 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)、过氧化物酶(peroxidase，POD)活性的测定

SOD活性采用南京建成的SOD试剂盒进行测定，以1 g组织在1 mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为1个SOD活力单位，结果以U/g表示。

CAT活性参考HAN等[15]的方法测定，以1 g样品1 min在240 nm处吸光值降低0.01为1个活性单位，结果以U/g表示。

POD活性的采用曹建康等[12]方法测定，以1 min吸光度变化值增加0.01时为1个过氧化物酶活性单位，结果以U/g表示。

1.3.8 H2O2和超氧阴离子自由基含量的测定

H2O2含量采用北京索莱宝试剂盒进行测定，结果以μmol/g表示。

含量采用北京盒子试剂盒进行测定，结果以μmol/g表示。

1.4 数据处理

采用Excel 2014整理数据，采用SPSS 25.0版软件分析实验数据。采用方差分析和邓肯的多重比较检验，P<0.05时差异显著，P<0.01时差异极显著，用Origin 2018绘图软件进行图表制作。

2 结果与分析

2.1 间歇热处理对西葫芦冷害指数的影响

冷害指数可以较为直观地判断果实冷害发生的程度。如图1所示，西葫芦冷害指数在低温贮藏期间呈不断上升的趋势，在贮藏前3 d，各组均未发生冷害。第6天，对照组和连续热处理组的西葫芦出现不同程度的冷害症状，主要表现为西葫芦表面开始失去光泽和出现水浸斑，而间歇热处理组的西葫芦未出现冷害，表明间歇热处理能够增强西葫芦低温贮藏期间的抗冷性。在贮藏结束时，间歇热处理组冷害指数最低，显著低于连续热处理组(P<0.05)，极显著低于对照组(P<0.01)。该结果表明间歇热处理可以显著减少西葫芦冷害的发生。

图1 间歇热处理对西葫芦冷害指数的影响
Fig.1 The effect of intermittent heat treatment on the chilling injury index of zucchini
注:不同小写字母表示同一时间处理间差异显著(P<0.05)(下同)

2.2 间歇热处理对西葫芦失重率的影响

果蔬贮藏时由于水分的消耗，会导致质量的减少和品质的变化。由图2可知，在贮藏过程中各组失重率均不断上升。在整个贮藏期间，与对照组相比，2种热处理均能减少西葫芦的失重率，其中间歇热处理组的失重率始终处于显著低于其他2组(P<0.05)。贮藏结束时，间歇热处理组失重率仅为1.9%，极显著低于对照组和连续热处理组(P<0.01)，表明间歇热处理对西葫芦冷藏期间失重率的增加有抑制作用，有助于减少西葫芦水分流失。

图2 间歇热处理对西葫芦失重率的影响
Fig.2 The effect of intermittent heat treatment on the weight loss rate of zucchini

2.3 间歇热处理对西葫芦硬度和色泽的影响

硬度和色泽可以直观地反映果蔬的贮藏品质，是影响果蔬采后商品价值的2个重要指标。果蔬贮藏过程中会随着水分的流失逐渐变软，甚至萎蔫，直接影响果蔬的质地和口感。间歇热处理对西葫芦硬度的影响如图3-a所示，在低温贮藏过程中，各处理组的硬度值均呈现下降的趋势，其中对照组在贮藏结束时已降至初始值的84.82%，表明低温贮藏时西葫芦果实的软化程度较为严重。而间歇热处理组果实的硬度显著高于同时期的对照组(P<0.05)，同时在第12、15和18天也均显著高于同期连续热处理组(P<0.05)。此外，在贮藏结束时间歇热处理组果实硬度与贮藏初期相比仅降低了7.69%，极显著高于连续热处理组(P<0.01)，这表明间歇热处理可以更有效地延缓西葫芦的软化。

西葫芦采后贮藏期间表皮颜色会逐渐变黄，a*值和b*值分别反映果皮颜色偏绿和偏黄的程度，其中a*值越小代表果皮越绿，b*值越大果皮越黄。由图3-b和图3-c可知，西葫芦的a*、b*值均随贮藏时间的延长逐渐增大，但各组果实a*、b*值增加程度存在一定差异。贮藏后期(12～18 d)，2种热处理组的a*、b*值增长程度均显著低于对照组 (P<0.05)。此外，在贮藏过程中，间歇热处理组a*、b*值一直处于较低水平，与对照组差异显著(P<0.05)，表明间歇热处理护色效果显著。

2.4 间歇热处理对西葫芦可溶性固形物和可溶性蛋白的影响

如图4-a所示，西葫芦可溶性固形物的含量均呈先升高后降低的趋势。在0～6 d时各组可溶性固形物含量不断上升，这与果蔬在贮藏过程中淀粉等大分子物质在水解酶的作用下水解成单糖导致糖分的积累有关，这有利于维持原生质和环境之间的渗透平衡，提高西葫芦的抗冷性[13,16]。在第6天时各组可溶性固形物含量达到峰值，其中间歇热处理组可溶性固形物含量上升最高，表明此处理组有利于提高西葫芦的抗冷性，这与冷害指数同步。贮藏结束时，2种热水处理组的可溶性固形物含量均高于对照组，且差异显著(P<0.05)，这可能是由于对照组冷害程度加深造成细胞膜透性增加，进而加剧有机物的消耗。此外，间歇热处理组西葫芦可溶性固形物含量均高于同时期其他试验组，表明间歇热处理对维持西葫芦可溶性固形物含量更具优势。

a-硬度；b-a*；c-b*
图3 间歇热处理对西葫芦硬度、果皮色差a*和b*值的影响
Fig.3 The effect of intermittent heat treatment on the hardness and the color difference a*and b*of the zucchini

可溶性蛋白是果蔬的重要的营养物，其含量的积累能够提高植物体的渗透调节，对果蔬抗寒性和抗冷性具有积极作用[17]。由图4-b可知，各组可溶性蛋白含量在18 d贮藏期内均呈先升高后降低的趋势。在贮藏前6 d，不同处理组的可溶性蛋白含量明显上升，这可能是冷敏果实在低温逆境下受到低温刺激自身合成一些小分子蛋白以增强其抗逆性[18]。2个热水处理组的可溶性蛋白含量上升程度均高于对照组，这可能是由于热水处理促使果实产生了热激蛋白导致蛋白质含量高于对照组，其中间歇热处理组的可溶性蛋白含量上升率为22.99%，显著高于对照组(P<0.05)。在贮藏第6天后，各处理组可溶性固形蛋白含量逐渐下降，且差异显著(P<0.05)，对照组西葫芦果实可溶性蛋白含量下降最快，这是由于果实冷害程度加深促使细胞结构完整性被破坏，进而抑制了蛋白质的合成。贮藏第18天时，对照组、连续热处理组和间歇热处理组可溶性蛋白含量分别比贮藏初期低41.79%、25.37%和15.92%。结果表明间歇热处理可以显著抑制可溶性蛋白质含量的下降，有利于西葫芦营养品质的保持。

a-可溶性固形物；b-可溶性蛋白
图4 间歇热处理对西葫芦可溶性固形物和可溶性 蛋白含量的影响
Fig.4 The effect of intermittent heat treatment on the soluble solids and soluble protein content of zucchini

2.5 间歇热处理对西葫芦相对电导率和MDA含量的影响

果蔬在受到低温胁迫时，会导致细胞膜受到损伤、透性增大，致使胞内电解质外渗，导致相对电导率升高[19]。由图5-a所示，在贮藏期间，各组西葫芦的相对电导率均呈上升趋势。在6 d时对照组相对电导率上升速率加快，而2种热处理组能抑制果实相对电导率的升高，这与对照组冷害程度的加深有关。贮藏结束时，间歇热处理组的相对电导率分别比连续热处理组和对照组低53.22%和22.97%，且差异显著(P<0.05)。这表明间歇热处理有助于维持西葫芦细胞膜的完整性。

MDA含量的变化与相对电导率一样表征细胞膜受伤害的程度，可以作为评价果蔬细胞膜完整性与冷害程度的指标[20]。如图5-b所示，各组西葫芦的MDA含量不断增加，说明果蔬在受到低温胁迫时，脂质自由基进一步诱发膜脂过氧化，进而促使MDA的积累。贮藏期间，2种热处理组MDA含量始终显著低于对照组(P<0.05)，其中间歇热处理组的MDA含量最低。贮藏第18天时，间歇热处理组MDA含量最低为1.52 μmol/g，与其他各组差异显著(P<0.05)，这表明间歇热处理可以有效缓解低温应激下西葫芦的膜脂质过氧化作用，维持细胞膜的完整性，提高果实的耐冷性。

a-相对电导率；b-MDA含量
图5 间歇热处理对西葫芦相对电导率和MDA含量的影响
Fig.5 The effect of intermittent heat treatment on the relative conductivity and MDA content of zucchini

2.6 间歇热处理对西葫芦SOD、CAT、POD活性的影响

SOD可以通过歧化反应将超氧阴离子自由基歧化成H2O2和O2，具有维持活性氧平衡和减少细胞膜系统氧化损伤的作用[21]。西葫芦SOD活性变化如图6-a所示，在0～9 d，各组SOD活性不断增加，这表明低温胁迫下西葫芦自身会产生调节代谢的保护性反应以减少冷害的发生，因此SOD活性会短暂增加。在此阶段，与连续热处理组相比，间歇热处理更能激发西葫芦果实抗氧化酶SOD的活性。在第9天各组SOD活性达到峰值，此时间歇热处理组SOD活性最高，比连续热处理组高出6.31%，是对照组的1.19倍。在第9～18天各组SOD活性呈不断降低趋势，直至贮藏结束，间歇热处理组和连续热处理组的SOD活性分别比对照组高11.89%和8.14%。总体来看，间歇热处理组SOD活性一直显著高于其他2组(P<0.05)，说明间歇热处理能够减少酶相关的蛋白失活和的聚集，延缓果实衰老。

CAT是植物细胞内重要的活性氧清除酶，能够分解植物体内的H2O2，以减少H2O2的积累对果实组织造成氧化损伤[19]。如图6-b所示，各组西葫芦CAT活性变化呈先增加后降低趋势，且均在第9天达到峰值。在第9天时，对照组的CAT值最低，比同时期连续热处理组和间歇热处理组分别低了18.96%和23.60%，表明热处理可以诱导西葫芦中CAT活性的升高，维持西葫芦果实细胞膜的稳定性，从而延缓了冷害的发生，这与西葫芦果实冷害指数结果保持一致。贮藏第18天，间歇热处理组显著高于同一时期的其他处理组 (P<0.05)，故间歇热处理可以维持较高的CAT活性，对于延缓低温贮藏下西葫芦果实的衰老更具有优势。

POD也是果蔬内清除H2O2的主要酶类，具有延缓膜脂过氧化进程及维持膜结构完整性的作用[22]。如图6-c所示，各组POD活性不断增加，其中2种热处理后的西葫芦POD活性始终显著高于同时期的对照组 (P<0.05)。在整个贮藏期间，间歇热处理组的POD活性一直处理最高水平，直至第18天时间歇热处理组POD活性分别为连续热处理组和对照组的1.09和1.28倍。研究结果表明低温贮藏时，间歇热处理能够诱导西葫芦果实POD活性的升高，有效地减轻细胞膜脂过氧化对细胞的损伤，提高了抗冷性。

a-SOD活性；b-CAT活性；c-POD活性
图6 间歇热处理对西葫芦SOD、CAT和POD含量的影响
Fig.6 The effect of intermittent heat treatment on the content of SOD, CAT and POD in zucchini

2.7 间歇热处理对西葫芦H2O2和含量的影响

如图7-a和图7-b所示，各组西葫芦的H2O2和含量均呈上升的趋势，其中对照组H2O2和含量在整个贮藏期均处于较高水平。在第3天时热处理组的H2O2和含量差异不显著(P>0.05)，但6～18 d间歇热处理组的H2O2和含量显著低于连续热处理组(P<0.05)，这与第6天后连续热处理冷害程度的加深有关。贮藏第18天时，对照组果实H2O2和含量较贮藏开始分别增长了5.65和7.62倍，而间歇热处理的H2O2和含量较贮藏开始仅增长了3.55和2.45倍，与对照组差异显著 (P<0.05)。说明间歇热处理在低温贮藏中更能抑制西葫芦H2O2和含量的上升，减少活性氧的积累。

a-H2O2含量；含量
图7 间歇热处理对西葫芦H2O2和含量的影响
Fig.7 The effect of intermittent heat treatment on the H2O2和

4 讨论

冷藏是保持采后果蔬营养品质并延长保鲜期的有效方法之一。但西葫芦在低温贮藏时极易发生冷害，表现出表面点蚀、凹陷病变和脱水软化等现象，严重影响采后西葫芦的贮藏保鲜[1]。本试验中，连续热处理和间歇热处理均能有效减轻西葫芦的冷害，减轻果实的失重和软化，维持果实较高的a*、b*值、可溶性固形物和可溶性蛋白含量，从而保持较好的营养品质和商品价值，且以间歇热处理的效果最佳。在血橙[10]和甘薯[8]的研究上也发现采用间歇热处理可更好地提高果实的抗冷性，延长贮藏期。这表明，间歇热处理可以更有效地保持西葫芦的品质。

MDA含量和相对电导率是评估组织细胞完整性重要的生理指标，果蔬在受到冷害时，会发生膜脂相变，破坏了细胞膜的完整性，导致膜渗透性增加，从而造成果实中MDA 含量和相对电导率升高[20]。已有研究表明，热处理可以通过抑制西葫芦果实MDA含量的积累和相对电导率的上升，使得细胞膜得到保护并减缓冷害指数的升高[13]。本研究表明，冷害指数与相对电导率和MDA含量显著正相关(r=0.829，r=0.904，P<0.05；r=0.841，r=0.912，P<0.01)。据此认为，西葫芦果实冷害的发生与MDA含量和相对电导率升高导致的细胞完整性被破坏有关，这一推断与何欢等[11]在杏果实的研究结果一致。与对照组相比，间歇热处理能够抑制西葫芦MDA含量和相对电导率含量的升高，且差异显著(P<0.05)，这说明间歇热处理更好地维持了细胞膜的稳定性，更有利于缓解低温对果实细胞膜的伤害。

当果蔬受到低温胁迫时会破坏果实内活性氧的动态平衡，触发组织中活性氧如和H2O2的积累，加速膜脂质的过氧化再生，导致活性氧代谢失调，造成膜结构成分的降解和损伤以及冷害的发生[23]。酶促抗氧化系统是控制活性氧产生的主要渠道，而SOD、CAT和POD是果蔬抗氧化系统中主要的抗氧化酶，具有维持果蔬体内活性氧代谢平衡的作用。其中，SOD通过歧化反应将转化为H2O2，CAT和POD可以将H2O2进一步分解成H2O和O2，从而减少氧化胁迫对机体的损伤[21]。已有许多研究表明，热处理可以通过提高SOD、CAT和POD的活性，抑制和H2O2的产生，延缓采后水蜜桃[22]、黄瓜[18]、枇杷[24]等果实的冷害症状。本研究发现，随着贮藏期内西葫芦冷害程度的加剧，H2O2和含量增加，冷害指数与H2O2和为极显著正相关(r=0.965，r=0.992，P<0.01)，表明冷害加剧与活性氧的积累与密切相关，此外，和H2O2与CAT负相关和H2O2与POD为显著正相关(r=0.953，P<0.01；r=0.978，P<0.01)。与对照组相比，热处理显著抑制了西葫芦果实贮藏期内冷害指数的上升，提高了SOD、CAT和POD的活性，同时延缓了H2O2和含量的升高，其中间歇热处理效果最优，表明间歇热处理可以使和H2O2在SOD、CAT和POD相互协调的作用下维持在较低水平，致使果实内活性氧积累减少，保持活性氧代谢的平衡，进而延缓贮藏期间西葫芦的冷害。此外，间歇热处理可以更好地维持西葫芦的抗氧化酶活性，减轻冷害的发生并提高了保鲜效果，这可能是由于间歇热处理让西葫芦内发生多次温差变化，促使果实内产生了短时叠加的应激反应，这可以避免连续的热应激积累造成的热损伤，促使更为强烈活性氧信号分子产生，增强了西葫芦的活性氧的清除能力，减轻冷害的发生[8]。

5 结论

本实验表明，连续热和间歇热处理均可以延缓西葫芦的冷害，保持果实较好的品质和营养成分，减少了相对电导率的增加，并抑制了MDA的积累，从而减少了果实细胞膜的损伤程度；同时能诱导西葫芦内SOD、CAT和POD活性的增强，维持果实内的活性氧代谢平衡，有利于西葫芦的贮藏保鲜。其中间歇热处理对减轻西葫芦果实冷害和提高贮藏品质的效果最为显著，其冷害指数分别比对照组和连续热处理组低36.36%、15.52%。本研究从活性氧代谢的角度探讨了间歇热处理减轻西葫芦果实冷害的原因，可为西葫芦冷害的控制提供参考。