基于矿物元素技术的品种、产区葡萄酒的判别分析

宁夏贺兰山东麓葡萄酒产区自2003年被国家列为“国家地理标志产品保护区”以来，所酿葡萄酒在国际上屡次获奖，已成为中国葡萄酒的代表性产区。葡萄酒的商业价值主要来源于产地和葡萄酒酿造生产的年份[1]，因此，有些不法商贩为了牟取利益，通过伪造地理标签的方式误导消费者，从而损害了消费者的利益，给品牌竞争带来信任危机。我国葡萄酒产业起步较晚，对于产区、品种葡萄酒的鉴别，手段更是匮乏，故葡萄酒市场比较混乱，亟需可靠、实用的葡萄酒原产地溯源技术和判别方法[2-3]。

农产品产地溯源主要是分析表征不同地域来源农产品的特异性指标，目前主要采用质谱、光谱和分子生物学等技术，通过分析农产品的矿物元素、挥发性成分、同位素含量与比率、DNA图谱等特征成分或指标，结合化学计量法，建立区分农产品产地来源的特征指纹图谱，从而对不同种类农产品进行产地溯源[4]。在影响农产品品质的自然条件因素中，原产地土壤环境的差异使其在很大程度上产生了独有的特点与个性[5]，因此，矿物元素分析技术被认为是植源性食品产地判别较为有效的方法[6-7]，已被广泛应用[8]，例如枸杞[9]、中药材粉葛[10]、新疆红枣[11]、茶叶[12-14]等的产地溯源，均取得了良好的判别效果。

本研究以宁夏贺兰山东麓不同品种(霞多丽、美乐、蛇龙珠、马瑟兰、赤霞珠、黑比诺)葡萄酒和我国不同产区(贺兰山东麓、武威产区和沙城产区)赤霞珠葡萄酒为研究对象，采用电感耦合等离子体质谱技术，分析葡萄酒中Ag、Al、As、Ba、Be、Bi等58种矿质元素，研究矿质元素在品种和产地葡萄酒判别中的可行性，研究成果可为葡萄酒品种、产地溯源提供科学方法和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验标准溶液选用美国Perkin Elmer公司的4组57种混合标准溶液(Ag、Al、As、Ba、Be、Bi、Ca、Cd、Co、Cr、Cs、Cu、Fe、Ga、Li、Mg、Mn、Na、Ni、Rb、Se、Sr、Tl、U、Zn；Au、Hf、Ir、Pd、Pt、Ru、Sb、Sn；B、Ge、Mo、Nb、P、Re、Ta、Ti、W、Zr；Ce、Er、Eu、Gd、Ho、Nd、Pr、Sc、Sm、Tb、Th、Tm、Y、Yb)和中国计量科学研究院的汞单元素标准溶液(Hg)，共计58种元素；质控样品选用生物成分分析标准物质胡萝卜(GBW 10047)，中国地质科学院地球物理地球化学勘查研究所；硝酸、盐酸(优级纯)，国药集团；水为实验室一级用水。

1.2 仪器与设备

ELAN DRC-e型电感耦合等离子体质谱仪(inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)，美国Perkin Elmer公司；Mars6 Xpress微波消解仪，美国CEM公司；AL104型电子天平，梅特勒-托利多。

1.3 实验方法

1.3.1 样品采集

供试葡萄酒采集自宁夏(银川、青铜峡、红寺堡等)(n=54)，涉及6个酿酒葡萄品种，包括霞多丽(n=9)、美乐(n=9)、蛇龙珠(n=6)、马瑟兰(n=11)、赤霞珠(n=9)和黑比诺(n=10);甘肃(n=6);河北(n=4)。其中甘肃的1个葡萄酒样本及河北的4个葡萄酒样本为多品种酿酒葡萄混合酿制的葡萄酒，不纳入品种间元素差异分析，样本采集时间为2020年。

1.3.2 样品前处理

葡萄酒样品先挥发乙醇，采用微波消解法消解，具体操作步骤：量取5.00 mL葡萄酒样品于微波消解管中，置于赶酸仪上120 ℃挥干乙醇，待冷却后加入硝酸10 mL，常温静置预消解3～4 h后，随后置于微波消解仪中进行消解。选择温度控制，10 min爬升至120 ℃，保持10 min；10 min爬升至150 ℃，保持20 min；10 min爬升至180 ℃，保持30 min，消解完毕完全冷却后，去掉盖子，置于赶酸仪上120 ℃赶酸3 h，然后冷却至室温，用水完全转移至25.0 mL刻度试管中，定容至刻度，混匀；同时做试剂空白。

1.3.3 矿物元素含量测定

电感耦合等离子体质谱仪测定元素采用标准模式。优化后的工作条件为：发生器功率：1 300 W；检测器模拟阶电压：-2 350 V；离子透镜电压：6.00 V；雾化器流量：0.98 L/min；等离子炬冷却气流量：17.0 L/min；辅助器流量：1.20 L/min。上机测定葡萄酒样品及GBW 10047中58种元素，GBW 10047的各元素测定结果均在标准参考值范围内。各元素标准曲线相关系数均>0.99，检出限为0.000 1 μg/L～3.66 mg/L(各元素测定的标准曲线、检出限和定量限见附表1，https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20211106.1444.002.html)。

1.4 数据处理

每个葡萄酒样本平行2次测定，平行测定结果的相对相差<10%的平均值作为最后结果进行数据处理分析。采用SPSS 25.0软件进行单因素方差、主成分分析和Fisher判别分析。

2 结果与分析

2.1 贺兰山东麓产区不同品种葡萄酒中矿物元素含量差异分析

由表1可知，葡萄酒中58种矿物元素均有检出，且含量差异较大。Mg元素含量最高(>100 mg/L)Na、P含量为10～100 mg/L，Al、B、Ca、Mn、Fe、Sr元素含量为1～10 mg/L，其次为Ce、Cr、Cu、Rb、Ti、Zn元素，(<1 mg/L)，其余元素含量均处于μg/L级。

通过对霞多丽、美乐、蛇龙珠、马瑟兰、赤霞珠和黑比诺6个单品葡萄酒中58种元素含量进行方差分析。其中As、B、Ba、Be、Cd、Co、Cr、Cu、Er、Gd、Hg、Li、Mo、Na、Nb、Ni、Sb、Sn、Sr、Tb、Ti、Th、Tl、Tm、U、Y、Yb、Fe、W、Hf、Pd、Ga、Zr、Re、Ca 35种元素含量在6个品种间存在显著差异(P<0.05)，元素Al、Bi、Ce、Cs、Eu、Ge、Ho、Mg、Mn、Nd、Pr、Rb、Sc、Se、Sm、Zn、P、Ru、Au、Ta、Ir、Pt、Ag 23种元素含量在品种间差异不显著(P>0.05)(表1)。霞多丽酿制的葡萄酒中Be、Er、Gd、Nb、Tb、Tl、Tm、Y、Yb、Hf、Pd、Zr、Ca 13种元素含量明显高于其他品种，而Cr、Cu、Ni、Sn、Sr、Fe、Ga、Re 8种元素含量低于其他品种；美乐酿制的葡萄酒中Cr、Cu和Re元素高于其他品种，As、Be、Ba、Co、Er、Gd、Hg、Li、Mo、Nb、W、Tb、Tl、Tm、Y、Yb、Pd 17种元素低于其他品种；蛇龙珠酿制的葡萄酒中As、Ba、Cd、Co、Na、U、W 7种元素含量明显高于其他品种酿制的葡萄酒；马瑟兰酿制的葡萄酒中B和Mo元素高于其他品种，Cd、Na、Hf、Zr低于其他品种；赤霞珠酿制的葡萄酒中Hg、Li、Ni、Sb、Sn、Sr、Ga、Fe 8种元素高于其他品种；黑比诺酿制的葡萄酒中B、Ca元素低于其他品种。宁夏种植的不同品种的酿酒葡萄酿制的葡萄酒中矿物元素含量有其各自的特征，矿物元素在不同品种之间具有较大的差异性。

2.2 葡萄酒中矿物元素的主成分分析

主成分分析技术是重要的指纹分析技术之一，它将多项指标重新组合成一组新的互相无关的几个综合指标，能够用较少指标反应较多信息的一种无监督分析方法[15-21]。本研究对宁夏产区不同品种葡萄酒存在显著差异的35种矿物元素进行主成分分析，KMO统计量为0.646(>0.5)，各元素之间具有显著相关性，可以进行主成分分析，结果见表2(详见附表2,https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20211106.1444.002.html)。第1主成分方差贡献率为28.645%，综合了Er、Y、Tb、Tm、Yb、Gd、Pd、Hf、Zr、Th 10种元素信息，这些元素均为碱金属和过渡金属；第2主成分方差贡献率为14.325%，综合了Sb、Na元素信息；第3主成分方差贡献率为7.401%，综合了Ni、Cr元素信息；第4主成分方差贡献率为6.658%，代表了Ba、Be、Ga元素信息；第5主成分方差贡献率为4.790%，代表了Re、Sr元素信息；第6主成分方差贡献率为4.559%，综合了Li、Sn元素信息；第7主成分方差贡献率为3.916%，代表了Mo元素信息；第8主成分方差贡献率为3.820%，代表了B元素信息；第9主成分方差贡献率为3.586%，代表了Cu元素信息；第10主成分方差贡献率为 2.940%，代表了Ca元素信息；前10个主成分累计方差贡献率为80.640%。筛选出Er、Y、Tb、Tm、Yb、Gd、Pd、Hf、Zr、Th、Sb、Na、Ni、Cr、Ba、Be、Ga、Re、Sr、Li、Sn、Mo、B、Cu、Ca 25种葡萄酒的特征矿物元素。

表1 不同品种酿酒葡萄酿制葡萄酒中矿物元素含量
Table 1 Content of mineral elements in wine made from different grape varieties

续表1

注：元素*表示元素质量浓度单位为μg/L，未标*的表示元素质量浓度单位为mg/L；表中数据均为平均值±标准差；同行不同的小写字母表示差异显著(P<0.05)

表2 前10个主成分的载荷矩阵及方差贡献率
Table 2 Load matrix and variance contribution rate of the first 10 principal components

2.3 不同品种葡萄酒的判别分析

矿物元素含量的差异揭示了不同品种酿酒葡萄酿制的葡萄酒存在差异，但不足以对不同品种葡萄酒进行准确判别，为了验证品种是否影响产地判别，采用Fisher判别分析法对宁夏贺兰山东麓产区6个品种酿酒葡萄酿制的葡萄酒进行品种判别。

建立基于Fisher判别函数的一般判别方法对葡萄酒样本进行多变量判别分析，以58种矿物元素作为判别分析的自变量，进行逐步判别分析。结果显示，Al、As、B、Ba 等40种对品种判别显著的元素被引入到判别模型中。不同品种葡萄酒判别函数模型系数见表3，判别分类结果见表4。提取模型前5个典型判别函数，Willks′ Lambda检验结果进一步证实，在α=0.05的显著性水平下，5个函数对分类效果均为显著，其中判别函数1和判别函数2累积解释判别模型能力为73.2%，且相关系数均>0.92，表明判别函数1和判别函数2对6个葡萄酒品种分类占主要贡献作用，利用判别函数1和判别函数2的得分值作散点图。如图1所示，霞多丽、黑比诺、马瑟兰3个品种容易区分，并分别位于不同空间，赤霞珠、美乐和蛇龙珠3个品种样本有部分重叠。分类结果表明：回代检验的整体正确判别率分别为100%，回代检验是针对所有训练样本进行的检验，样品的错判率是相应总体率的偏低估计，而交叉检验比较真实地体现了模型的判别能力[22]，交叉检验整体正确判别率仅为38.9%，每个品种均有大部分样本被误判，说明基于矿物元素的差异不能有效鉴别不同品种的葡萄酒。

图1 不同品种葡萄酒前2个典型判别函数得分散点图
Fig.1 Scattering points of the first two typical discrimination functions of wines from different varity

表3 不同品种酿酒葡萄酿制的葡萄酒判别函数模型系数
Table 3 Wine discriminant function model coefficients of different varieties of wine grapes

2.4 不同产地葡萄酒的判别分析

为了验证矿物元素分析技术对葡萄酒产地判别的可行性，建立基于Fisher判别函数的一般判别方法对宁夏贺兰山东麓、甘肃武威、河北沙城产区葡萄酒样本进行多变量判别分析，以58种矿物元素作为判别分析的自变量，进行逐步判别分析，结果显示，Al、B、Cs、Na、Rb、Sr、Ti、Fe、Zn、Pt、Re 11种对产地判别显著的元素被引入到判别模型中。不同产地葡萄酒判别函数模型系数见表5，判别分类结果见表6。提取模型前2个典型判别函数对分类效果均为显著，利用判别函数1和判别函数2的得分值作散点图，如图2所示，宁夏贺兰山东麓、河北沙城、甘肃武威3个产地容易区分，并分别位于不同空间。分类结果表明：回代检验和交叉检验的整体正确判别率分别为100%和98.4%，说明基于矿物元素指纹的差异可有效鉴别不同产地的葡萄酒。

表4 不同品种酿酒葡萄葡萄酒的一般判别分析结果
Table 4 Results of general discriminant analysis of different varieties of wine grape wine

表5 不同产地葡萄酒判别函数模型系数
Table 5 Coefficient of discriminant function model for wines from different provenances

表6 不同产地葡萄酒的一般判别分析结果
Table 6 Results of general discriminant analysis of wines from different regions

图2 不同产地葡萄酒前2个典型判别函数得分散点图
Fig.2 The scatter points of the first two typical discriminant functions were obtained

3 结论

通过分析宁夏贺兰山东麓产区的霞多丽、美乐、蛇龙珠、马瑟兰、赤霞珠、黑比诺6个单品葡萄酒中58种矿物元素含量及组成特征，明确了As、B、Ba、Be、Cd、Co、Cr、Cu、Er、Gd、Hg、Li、Mo、Na、Nb、Ni、Sb、Sn、Sr、Tb、Ti、Th、Tl、Tm、U、Y、Yb、Fe、W、Hf、Pd、Ga、Zr、Re、Ca 35种元素含量存在显著差异(P<0.05)。通过主成分分析确定了Er、Y、Tb、Tm、Yb、Gd、Pd、Hf、Zr、Th、Sb、Na、Ni、Cr、Ba、Be、Ga、Re、Sr、Li、Sn、Mo、B、Cu、Ca 25品种葡萄酒的特征矿物元素。Fisher判别分析确定了Cd、Ce、Co、Cu、Gd、Hg、Mg、Se、Zn、P 10种葡萄酒的有效溯源指标。Fisher判别分析方法构建的判别模型的回代检验的整体正确判别率为97.3%，但是交叉检验的整体正确判别率仅为35.6%，故基于矿物元素的差异不能有效鉴别不同品种的葡萄酒。

通过基于Fisher判别函数的一般判别方法对宁夏贺兰山东麓产区、甘肃武威产区和河北沙城产区葡萄酒样本中58种矿质元素进行多变量判别分析显示，Al、B、Cs、Na、Rb、Sr、Ti、Fe、Zn、Pt、Re 11种对产地判别显著的元素被引入到判别模型中，回代检验和的交叉检验整体正确判别率分别为100%和98.4%，说明基于矿物元素指纹的差异可有效鉴别不同产地的葡萄酒。

综合以上分析，矿物元素技术结合多元统计分析方法对产地葡萄酒的判别有效可行，建立的基于Fisher判别模型可用于葡萄酒原产地的识别，对地理标志产品葡萄酒及消费者合法权益的保护提供了有效的技术支撑。