羟基磷灰石-氧化石墨烯复合微球的制备及性能

试剂：磷酸氢二钠（（NH₃）₂HPO₄）和二水氯化钙（CaCl₂·2H₂O）购于上海阿拉丁试剂有限公司；碳酸钠（Na₂CO₃）、柠 檬 酸（C₆H₈O₇）和 无 水 乙 醇（CH₃CH₂OH）购自广州市东红化工厂；姜黄素（C₂₁H₂₀O₆，药用级别，98%）购自上海源叶生物科技有限公司；氧化石墨烯购自湖南丰化材料发展有限公司；中国仓鼠卵巢细胞株购自江苏凯基生物技术股份有限公司.

仪器：主要有日本岛津傅里叶变换红外光谱仪、德国Bruker的（D8-ADVANCE）X射线粉末衍射仪、日本电子株式会社公司的JSM-7800&TEAM型场发射扫描电子显微镜、英国雷尼绍公共有限公司的InVia Reflex型激光显微共聚焦拉曼红外光谱仪以及Micromeritics公司的全自动比表面积与孔隙度分析仪.

依据ISO 10993. 1-2018医疗器械的生物学评估标准对载体材料进行体外细胞毒性测试，采用CCK-8法检测细胞毒性^[18]．称取0. 9 g样品浸泡在无水乙醇24 h，过滤干燥后紫外消毒灭菌．再将样品浸泡在20 mL的完全培养基中，37℃、CO₂恒温培养浸提24 h，采用微孔滤膜过滤，收回浸提液．并以此浸提液浓度为基准划分体积分数梯度，依次为 1. 0%、 5. 0%、 10. 0%、 20. 0%、 50. 0%、70. 0%、80. 0%和100. 0%的浸提液和完全培养基9个梯度，以完全培养基作为对照组，其余作为实验组．将中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）细胞接种于96孔板，每组10孔．各组分别加入200 μL对照培养液或不同浓度的浸提液．培养72 h后，在每孔加入CCK-8试剂，轻微震荡后继续放入恒温细胞培养箱中培养，2～3 h后用实时酶联免疫检测仪测量各孔在450 nm波长处的光密度值D（4 5 0），实验重复测5次，取平均值，计算得出细胞相对增殖率.

配制一系列姜黄素无水乙醇溶液测定吸光度，计算回归方程，建立标准曲线.

分别称取4种CaCO₃-GO模型生成的HA-GO样品各50 mg，将它们置于姜黄素的乙醇溶液中匀速混合24 h．在8 000 r/min下离心15 min，分离并收集上清液，重复加入无水乙醇离心，使收集到的上清液总量为20 mL．测量上清混合液的光密度，通过与之前姜黄素乙醇溶液的标准曲线对比，计算微球的载药量和包封率，并设置3个平行实验以减少误差．同时取空白样，置于无水乙醇中同样操作，排除空白微球的浸出物对测试过程的影响．包封率和载药量的计算公式为

按2015版中国药典的规定对载药微球进行体外释放试验^[19]，释放溶液使用体积分数为20%的乙醇稀盐酸溶液来模拟人工胃液（pH=1. 5）. 称取50 mg载药样品，放入透析袋中，然后放入释放溶液中，在37℃水浴条件下搅拌，进行药物缓释实验．分别于0. 5、1、2、4、8、12、24、48、72和96 h时取出4 mL释放溶液，同时补充4 mL模拟的人工胃液，测量各个时间点释放溶液的在波长为（427 ± 1）nm处吸光度，同样进行3个平行样测试，减小误差．缓冲液中药物的累积释放率E为其中， V₀为缓冲溶液的总体积（单位： mL）； V为每次取出缓冲溶液的体积（单位： m L ）； ρ_n为第n次吸取缓冲溶液时测定的药物质量浓度（单位：mg/mL）；ρ_i为第i次置换取样时测定的药物溶液质量浓度（单位：mg/mL）；m (药物)为载药微球中包裹的药物质量（单位：mg） .

图1为不同反应浓度条件下制备的CaCO₃-GO的XRD图谱．碳酸钙主要有文石、方解石和球霰石3种无水结晶相．方解石是热力学最稳定，能量最低的晶型，而球霰石是热力学最不稳定．能量最高，文石介于两者之间^[20]．低反应浓度（c（CaCl₂）=c（Na₂CO₃）=0. 1 mol/L）与高反应浓度（c（CaCl₂）=c（Na₂CO₃）=1. 0 mol/L）得到的XRD图谱显示均为方解石晶型，根据比对方解石的标准卡片（PDF#05-0586），图谱的强衍射峰基本与方解石的（104）、（018）和（116）等晶面符合，进而可以判断合成的为方解石的碳酸钙．对比球霰石的标准卡片（PDF#33-0268），在0. 3 mol/L反应条件下，出现球霰石的衍射峰，其（112）和（114）晶面衍射峰强度很高，不过仍然显示存在方解石的衍射峰．在0. 5 mol/L时，也可以明显看出两种晶型的衍射峰同时存在，但方解石的衍射峰强度强一些．说明在低反应浓度时生成的主要是热力学较稳定的方解石晶型的CaCO₃，在增大反应浓度后，部分方解石晶型向球霰石晶型转化，但浓度增大到一定程度时，存在形式又转化为稳定的方解石．说明反应浓度确实影响碳酸钙的晶型变化，在适当的反应浓度下可以生成球霰石晶型．GO的特征衍射峰在2θ=11. 7°处，可能由于本实验中强度太弱，没有检测到．

图1 不同反应浓度制备的CaCO3-GO的XRD图谱Fig. 1 The XRD patterns of CaCO3-GO prepared with different reaction concentrations.

图2为不同反应浓度度条件下制备的CaCO₃-GO的FTIR图谱．由图2可见，c（CaCl₂）=c（Na₂CO₃）分别为0. 1 mol/L和1. 0 mol/L制备的样品中在712 cm^-1处有明显吸收峰，属于方解石的CO₃^2-基团的O—C—O面内变形振动峰．而0. 5 mol/L样品在745 cm^-1处出现吸收峰，这属于球霰石的CO₃^2-基团的O—C—O面内变形振动峰，同时也在712 cm^-1有明显吸收峰，说明方解石与球霰石2种晶型共存．当反应浓度为0. 3 mol/L时，712 cm^-1处的吸收峰较弱，不太明显；745 cm^-1处的球霰石吸收峰比较明显而且清晰，说明此样品主要是球霰石型的CaCO₃，这也与上述XRD分析结果一致.

图2 不同反应浓度制备的CaCO3-GO的FTIR图谱Fig. 2 FTIR images of CaCO3-GO prepared with different reaction concentrations.

图3为不同反应浓度制备的CaCO₃-GO的FESEM图像．从图3可明显看出，低反应浓度时合成的是棒状颗粒，长度为1. 0～2. 5 μm，直径在100～200 nm，呈束状聚集（如0. 1 mol/L时）；当反应浓度增大到0. 3 mol/L时，出现球状颗粒，且表面光滑，球状比较完整，部分呈椭球状，夹杂少许棒状颗粒，球形的粒径为0. 9～2. 0 μm，粒径分布比较均匀；当浓度增至0. 5 mol/L时，球状减少，多呈圆饼状且大小不一，同时还有不太规则的棒状存在；当高反应浓度1. 0 mol/L时，基本上没有微米级的可辨识形貌，只有纳米颗粒呈团聚分布．从图3可明显看出，反应浓度对碳酸钙是否能呈现微球状的形貌有重要的影响.

图3 （a）0. 1CaCO3-GO、（b）0. 3CaCO3-GO、（c）0. 5CaCO3-GO和（d）1. 0CaCO3-GO的FESEM图像Fig. 3 FESEM images of (a) 0. 1CaCO3-GO, (b) 0. 3CaCO3-GO, (c) 0. 5CaCO3-GO, and (d) 1. 0CaCO3-GO.

图4为4种不同初始反应浓度制备的CaCO₃-GO水热后生成的HA-GO的XRD图谱．总体来看，碳酸钙的衍射峰基本消失．与HA的标准卡片（PDF# 09-0432）对比可以看出，不同反应浓度下生成的HA-GO复合物均出现HA的特征衍射峰^[21-22]．说明CaCO₃转化成了HA，且纯度也比较高．同时，在2θ≈11°时有很微弱的峰，此处为HA与GO重叠的衍射峰.

图4 不同初始反应浓度制备的CaCO3-GO水热后生成的HA-GO的XRD图谱Fig. 4 XRD patterns of HA-GO generated from CaCO3-GO prepared by different initial reaction concentrations after hydrothermal treatment.

图5为不同初始反应浓度制备的CaCO₃-GO水热后生成的HA-GO的傅里叶红外图谱．由图5可见，在569和605 cm^-1处为PO₄^3-基团的弯曲振动峰， 1 050 cm^-1处的吸收峰为PO₄^3-基团的伸缩振动吸收峰^[23]．同时还发现，712 cm^-1处的球霰石的CO₃^2-基团振动峰已消失，745 cm^-1处方解石的特征吸收峰也不再出现．1 462 cm^-1和415 cm^-1处为GO的C—O振动峰，也为CO₃^2-基团的C—O振动峰，可能是由于水热反应后仍有部分CO₃^2-存在于HA中．3 500 cm^-1处的吸收峰应该是GO的—OH峰．结合上述XRD分析，碳酸钙已基本转化为HA，说明该水热反应条件下阴离子交换比较彻底.

图5 不同初始反应浓度制备的CaCO3-GO水热后生成的HA-GO的傅里叶红外图谱Fig. 5 FTIR patterns of HA-GO generated from CaCO3-GO prepared by different initial reaction concentrations after hydrothermal treatment.

图6为不同反应浓度下制备的HA-GO的SEM图．在图6（a）中，0. 1CaCO₃-GO经过水热反应后得到0. 1HA-GO粉末，虽然其基本形态还呈棒状，不过已转化为HA颗粒，呈散乱分布；图6（b）为0. 3HA-GO，从形貌上看基本成球状，从部分破碎的微球可以发现内部呈中空结构，微球表面十分粗糙，大小比较均一；图6（c）为0. 5HA-GO，可以看到部分微球缀连在GO的边缘；从图6（d）的高倍电镜下可以看到，微球表面有明显的颗粒存在，这是转化后的纳米HA生成在表面；而图6（e）中的1. 0HA-GO已经团聚成块状了．

图7是在180℃进行CaCO₃-GO水热反应，反应时间分别为3、6和12 h生成的HA-GO的XRD图谱．由图7可见，当反应时间为3h时，对比标准卡片已经出现HA的晶相，而球霰石的特征衍射峰仍然存在，说明两者共同存在，此时CaCO₃已经开始转化为HA．经过高温高压，PO₄^3-开始跟CaCO₃中的CO₃^2-进行交换^[24]，但仍有CaCO₃的衍射峰，说明部分CaCO₃没有转化成功．而随着时间的延长，交换越来越彻底，在反应6 h和12 h时，已经没有CaCO₃的衍射峰，说明CaCO₃已完全转化为HA.

图6 （a）0. 1HA-GO、（b）0. 3HA-GO、（c）0. 5HA-GO、（d）16 000倍镜下的0. 3HA-GO和（e）22 500倍镜下的1. 0 HA-GO的SEM图Fig. 6 SEM images of (a) 0. 1HA-GO, (b) 0. 3HA-GO, (c) 0. 5HA-GO, (d) high magnification of 0. 3HA-GO, and (e) 1. 0 HA-GO.

图7 不同水热时间制备的HA-GO的XRD图谱Fig. 7 XRD patterns of HA-GO prepared at different hydrothermal times.

图8为不同水热反应时间（3、6和12 h）条件下制备的HA-GO的SEM图像．由图8可以看出，样品基本都呈球状，并保持模板CaCO₃的形态．水热反应时间3h的样品，微球表面粗糙，且有微小的颗粒存在．反应时间为6h时，微球更加粗糙，表面颗粒变大．增加水热时间至12 h，有的微球破碎，表面粗糙，内部呈现中空结构，有网络状微结构存在．结合XRD分析，可以看出水热反应时间为6 h时能获得形貌较好、转化彻底的HA-GO微球．

图8 水热时间分别为（a）3 h、（b）6 h和（c）12 h制备的HA-GO的SEM图Fig. 8 SEM images of HA-GO prepared with hydrothermal time of (a) 3 h, (b) 6 h, and (c) 12 h.

因此，以下实验将使用0. 3HA-GO且水热反应时间为6 h、形貌较好的复合微球进行相关测试分析.

图9为HA-GO复合微球的拉曼光谱．从图9可见，在1 350 cm^-1处，GO和0. 3HA-GO都有1个明显的振动峰，称为D带，这是石墨烯的无序振动峰．位于1 600 cm^-1的峰属于石墨烯的本征拉曼模式，称为G带．589和960 cm^-1分别对应于v3 （PO₄^3-）反对称变角振动峰及v1（PO₄^3-）对称伸缩振动峰，是HA的特征峰．用D带与G带的强度比（I_D/ I_G）表征石墨烯材料的无序度．GO的I_D/ I_G=0. 85，HA-GO的I_D/I_G=0. 94，复合样品拥有较高的I_D/I_G，表明复合样品中GO的缺陷密度增加.

图 10是0. 3HA-GO微球的Barrett-Joyner-Halenda （BJH）孔径分布图以及吸脱附等温曲线．根据吸脱附等温曲线可知，微球的吸脱附等温曲线符合典型的Ⅲ型等温线，其滞后环为H3型^[25]，说明微球的组成微粒之间存在许多狭缝型的孔隙，观察相应SEM图也可相互印证这点．测得比表面积为22. 71 m²/g．根据孔径大小分类：孔径≤2 nm为微孔；孔径介于2～50 nm的为介孔；孔径≥50 nm为大孔．通过BJH法分析微球孔径可知，微球的平均孔径为30～50 nm，属于介孔材料．结合以上分析可知，制备的HA-GO复合微球是内部中空结构的介孔材料．

图9 GO和0.3HA-GO复合微球的拉曼光谱Fig. 9 Raman spectra of GO and 0. 3HA-GO composite microspheres.

图 10 HA-GO微球的BJH孔径分布图及吸脱附等温曲线（a）BJH孔径分布；（b）吸脱附等温曲线Fig.10 Adsorption-desorption isotherm curve of HA-GO microspheres. (a) BJH pore size distribution map, (b) adsorption and desorption isotherms.

通过体外培养CHO细胞评估HA-GO复合微球对细胞增殖的影响，结果如图 11．CCK-8的结果表明，以对照组统计学数量为参考标准，不同浓度的浸提液对细胞增殖基本没有负面影响，说明含复合微球物质的培养液没有毒性，因而复合微球对细胞增殖基本上没有毒性．

图 11 不同体积分数的微球浸提液培养下的细胞相对增殖率Fig. 11 Relative proliferation rates in culture extracts of different amounts of the microspheres.

通过紫外分光光度计测定得到姜黄素在无水乙醇中的最佳吸收波长为（427 ± 1）nm．同时，在（427 ± 1）nm波长处测定配置的一系列姜黄素乙醇溶液的吸光度，绘制标准曲线如图 12．通过线性拟合，发现在姜黄素乙醇溶液质量浓度为0. 05～2. 0 μg/mL内呈良好线性关系.

图 12 姜黄素在无水乙醇中的标准曲线Fig. 12 Standard curve of curcumin in absolute ethanol. Black square is the experimental data，and red line is the fitting curve.

包封率和载药量是衡量载药微球载药性能的重要指标，载药量和包封率高可使微球材料得到充分利用，从而减少原材料的浪费和给药次数，减轻患者频繁给药的痛苦，临床应用价值更高．图 13为复合微球的包封率及载药量，由图 13可见， 0. 3HA-GO的样品拥有较好的负载能力，其载药量达到（2. 95 ± 0. 19）% ，包封率达到（20. 90 ± 0. 31）%．这主要是因为0. 3HA-GO形成的是表面粗糙内部中空的微球，给药物提供了更多的着位点，利于药物吸附．

图 13 HA-GO的包封率与载药量的柱状图Fig. 13 Histograms of drug encapsulation efficiency (black) and drug loading (red) of HA-GO.

由于姜黄素属于醇溶性物质，因此使用体积分数为20%的乙醇稀盐酸溶液（pH=1. 5）作为模拟人工胃液进行体外释药测试（图 14）．由图 14可以看出，载药复合微球初释放时呈平稳释放，没有明显的突释现象，在给药后120 h时的累计释放率达到72%．由曲线的走势来看，释放率还在缓慢抬升，说明药物后期还会释放，最终药物累积释放率将高于72%，说明HA-GO微球既能起到缓释，又能基本将药物完全释放.

图 14 载药微球在体积分数为20%乙醇的模拟人工胃液（pH=1. 4）中的累积释放率随时间变化Fig. 14 Cumulative release rate of drug-loaded microspheres in artificial gastric juice (pH=1. 4) supplemented with volume fraction of 20% ethanol changes with time.