Janus石墨烯量子点在生物膜中的输运行为：分子动力学模拟

石墨烯量子点（graphene quantum dots, GQDs）是一种同时具有石墨烯和碳量子点特性的零维材料，由单层或多层石墨烯组成，尺寸小于100 nm[1]。因其可调的光致发光特性、独特的物理化学性质、良好的生物相容性和微纳尺寸等特点[2-3]，被广泛用于生物医学、化工新材料、能源器件等前沿领域。在生物医药领域，石墨烯量子点作为纳米载体可以将药物定点递送至肿瘤细胞，进而实现靶向治疗。在此过程中，跨膜输运是实现药物递送的重要环节，也是提高纳米载体靶向输运效率、减少生物积累、降低细胞毒性的关键[4]。

近年来，国内外学者分别从纳米材料的尺寸、形状、化学组成、亲/疏水性等方面，探索了石墨烯量子点物理化学性质对跨膜输运行为的影响[4-6]。其中，在石墨烯量子点与细胞膜相互作用机制研究方面，岳华等[7]综述了纳米石墨烯与细胞膜间的生物刺激响应机制，枚举了不同结构的纳米石墨烯在细胞膜表面发生的多种复杂内化形式，包括水平摩擦式、竖直嵌入式、三明治超级组装、选择性胞吞、胞内限域折叠等。周梦迪等[8]综述了近年来石墨烯与细胞膜、蛋白质和DNA等生物大分子相互作用的研究进展，为石墨烯的生物医药应用及安全性评价提供了重要参考。目前，调控石墨烯量子点的物理化学性质已成为研究热点，其核心在于强化界面处的分子传递、能量转化机制[9]。在跨膜输运过程中，石墨烯量子点与细胞膜及其周围特异性环境接触，形成异质性空间分布，即构成“纳米-生物”微界面，通过界面处的动态物理化学作用以及能量交换实现跨膜输运[10]。因此，认识和理解由石墨烯量子点构成的“纳米-生物”微界面热力学行为至关重要[11]。目前，对“纳米-生物”微界面开展的研究初步表明，微界面处的各种分子会产生不同形式的能量和分子间作用（包括静电作用、范德华作用、溶剂化作用等），进而主导着整个跨膜输运过程[12]。

分子模拟技术在研究非平衡态界面热力学方面发挥了关键作用[13-14]，它不仅能从分子尺度诠释实验结果，还能为微纳界面处的各种物理化学过程提供新的见解[15-18]，已被广泛用于纳米载体与细胞膜相互作用机制研究[8,19-20]。例如，Shen等采用全原子分子动力学报道了石墨烯量子点跨膜输运行为，发现石墨烯量子点的尺寸越大跨膜输运能垒越高[21]；较小尺寸的石墨烯量子点作为纳米载体可以显著降低阿霉素、脱氧腺苷药物的跨膜输运能垒[22]。Li等[6]利用耗散粒子动力学模拟研究了锥形石墨烯跨膜输运行为，发现尖端形状、尺寸和表面疏水特性都会影响其跨膜能垒，而石墨烯的弯曲刚度对其渗透过程的影响却很小。最新研究发现增加石墨烯的氧化程度有助于提高其药物输送效率，降低细胞毒性[5,19,23]。与氧化官能团均匀分布的传统石墨烯不同，Janus石墨烯量子点在石墨烯片两端呈现空间不对称结构及表面化学性质，类似于表面活性剂的结构特性[24]。因此，Janus石墨烯量子点跨膜输运行为同时受到氧化位点空间异质分布、氧化程度（亲水-亲油平衡）共同影响，进而可能诱导产生特殊的跨膜输运行为。尽管氧化官能团的空间异质分布对其跨膜输运有较大影响，但这方面的研究较少。

从热力学角度分析Janus石墨烯量子点空间异质分布及氧化程度对跨膜输运的影响，有助于总结其跨膜输运规律，阐明相关构-效关系，指导结构设计。本文从空间异质结构设计出发，构建了一系列不同氧化程度与空间异质分布的Janus石墨烯量子点，并利用全原子拉伸分子动力学（steered molecular dynamics，SMD）模拟研究了其跨膜输运过程中的能量特征，重点考察Janus石墨烯量子点亲水-亲油平衡、外力牵引对其跨膜输运行为的影响规律，为Janus石墨烯量子点的设计及生物医药应用提供指导。

1 分子动力学模拟

1.1 分子模型与力场

本文以二棕榈酰磷脂酰胆碱（dipalmitoylphosphatidylcholine，DPPC）为细胞膜磷脂双分子层主要成分，利用Packmol软件构建双层细胞膜结构，膜厚度约4.5 nm。为构建不同氧化程度与空间分布的Janus石墨烯量子点，本文采用东京大学开发的网页版PolyParGen力场工具（http://polypargen.com/）构建相关分子结构及力场参数。该工具能为聚合物或大分子提供OPLS-aa和Amber力场参数，包括分子动力学模拟需要的非键相互作用参数、键合相互作用参数。本文采用OPLS-aa力场描述分子间相互作用，其中，非键相互作用由Lennard-Jones 12-6势函数及库仑作用势函数加和得到，计算方程如下：

Enon-bonded=∑i>jfij4εijσijrij12-σijrij6+qiqj4πε0rij（1）

式中，σij、εij为原子间的Lennard-Jones势函数参数，不同原子间的Lennard-Jones参数依据Lorentz-Berthelot混合规则计算可得；rij为原子间的距离，nm；qi、qj分别为i原子、j原子所带电荷，C；ε0为介电常数，F/m。此外，一般分子内1，4交互作用系数fij为0.5，其他均取为1.0[25]。

键合相互作用参数分别由键长、键角、扭转角势能项构成，计算公式分别如下：

Ebond=∑bondsKr(r-req)2（2）Eangle=∑anglesKθ(θ-θeq)2（3）Etorsion=Vn21±cosnϕ-ϕn（4）

式中，Kr、Kθ、Vn分别为键长、键角、扭转角势能项中的系数；req为平衡时键长距离，nm；θeq为平衡时键角，(°)；ϕn为扭转角多项式的平衡角度，(°)。

本文采用PolyParGen力场工具为DPPC分子及Janus石墨烯量子点构建的相关OPLS-aa力场参数。该工具已广泛应用于各种有机物的物理化学、热力学性质计算，其结果与实验结果良好吻合[26-29]。溶剂水分子设置为扩展简单点电荷SPC/E模型[30]。图1为构建的模拟系统和不同空间异质分布、不同氧化程度的Janus石墨烯量子点结构示意图。如图1（a）所示，细胞膜由312个DPPC分子构成，添加近5.3×104个溶剂分子，进而组成尺寸为10.0 nm×10.0 nm×20.0 nm的模拟系统。在初始构型中，溶剂密度接近1.0 g/cm3，Janus石墨烯量子点以亲水端垂直放置于细胞膜表面0.5 nm处。事实上，Janus石墨烯量子点的制备与运用已被报道。例如，Zhang等[24]结合插层氧化和强超声剥离技术制备了一系列Janus石墨烯量子点，其结构表征如图1（b）所示[24]。为模仿该结构，同时也为探究氧化官能团空间异质分布对跨膜输运的影响，本文分别构建三角形、方形空间异质分布的Janus石墨烯量子点，如图1（c）、（d）所示。构建的Janus石墨烯量子点的尺寸为2.0 nm×4.6 nm，具体的Janus石墨烯量子点氧化特性参数如表1所示，氧化程度为7.213%~15.29%。本文石墨烯氧化程度定义为：NO/（NC+NO），其中，NO为氧原子数目，NC为碳原子数目。构建的氧化石墨烯C∶O约为2.88，高于实验制备的1.4~2.2[31]，这主要因为Janus石墨烯量子点一端未被氧化造成的。此外，氧化官能团中的羟基（R—OH）、羧基（R—COOH）、环氧基（R—O—R′）官能团比例为1.0∶0.86∶1.0~1.0∶1.75∶1.0，接近实验制备的1.05∶0.9∶1.0~1.0∶1.2∶0.96[31-32]，其中羧基比例较实验结果高，这主要是由于氧化官能团异质分布导致的边际碳原子比例增加造成的。

图1

图1   模拟系统示意图及模拟与实验的Janus石墨烯量子点结构比较(图1(b)经文献[24]复制许可，版权所有为2020 Elsevier Ltd.)

Fig.1   Schematics of mimicked system and structure comparison of Janus graphene quantum dots derived from simulation and experiment (Fig. 1 (b) is reproduced with permission from Ref. [24], copyright 2020 Elsevier Ltd.)

表1   Janus石墨烯量子点氧化特性参数

Table 1  Oxidation characteristics of Janus graphene quantum dots

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1.2 模拟细节

在进行分子动力学模拟之前，系统先通过最速下降法降低体系总能量，使得系统松弛。当体系势能小于1000.0 kJ/(mol·nm)时结束计算，以避免初始构型因原子重叠而造成的局部能量过高，提高体系的稳定性；进而在NVT（constant-temperature, constant-volume）系综条件下进行0.05 ns分子动力学模拟，最后在NPT（constant-temperature, constant-pressure）系综条件下执行200.0 ns动力学平衡计算。该计算过程采用Berendsen温度耦合算法控温，温度保持在300 K，采用Parrinello-Rahman压力耦合算法控压，耦合类型为Semi-isotropic，压力耦合时间常数为2.0 ps，且系统压力保持在1.0 bar（1 bar=105 Pa）[30]。所有键长采用LINCS算法约束，长程静电相互作用采用PME算法，截断半径为12.5 Å(1Å=0.1 nm)[33]。采用周期性边界条件，计算步长设置为2.0 fs，每100.0 ps输出一帧结果文件，用于计算系统的各种能量和结构变化。动力学模拟由高性能分子模拟计算软件包Gromacs 2019.6执行完成，计算任务在配备为256 GB内存的双路Intel(R) Xeon(R) Gold 6130 CPU@2.10GHz多节点计算平台运行，为加速动力学计算，长程静电相互作用部分采用CPU计算，Lennard-Jones及键合作用部分采用NVIDIA GeForce RTX 3090加速显卡计算。计算得到的模拟结果利用Visual Molecular Dynamics（VMD）可视化软件作图，动力学轨迹性质分析由Gromacs软件后处理工具和实验室编写脚本完成。本文计算的分子间范德华、静电相互能量曲线是基于Gromacs软件中的rerun与energy命令实现的。首先提取两组分轨迹文件，再使用rerun命令重新计算轨迹，最后使用energy命令计算该轨迹产生的各个能量项。

2 结果与讨论

2.1 外力依赖的跨膜行为

为加快Janus石墨烯量子点跨膜输运过程，采用拉伸分子动力学模拟[20]探究不同拉伸强度条件下Janus石墨烯量子点跨膜输运行为。使用弹簧势线性恒力拉动量子点的质心向细胞膜逐渐靠近，拉伸强度为200.0~1600.0 kJ/(mol·nm)。其中，拉伸强度为800.0 kJ/(mol·nm)时，中等氧化强度(12.27%)的Janus石墨烯量子点跨膜输运路径俯视图如图2（a）所示。可以观察到，在初始阶段，为了避免高的跨膜能垒，Janus石墨烯量子点首先利用其亲水头部选择性地吸附在细胞膜表面。在随后的50.0 ns内，拖拽自身疏水尾部渗透至细胞膜内。随着模拟的时间增加，在200.0 ns时，观测到稳定的跨膜内化构型，其中亲水头部朝向溶剂，而疏水尾部嵌入至细胞膜内。Janus石墨烯量子点与报道的石墨烯、氧化石墨烯量子点的跨膜输运行为有较大差异。例如，Li等[4]基于分子模拟与实验结果，观测到疏水的石墨烯刺穿渗透至细胞膜是由石墨烯材料的不规则边缘或凹凸结构诱导发生的。而对于传统的氧化石墨烯量子点，Dallavalle等[23]发现，氧化官能团随机分布在石墨烯表面有利于其实现纵向跨膜。本文观测到的Janus石墨烯量子点跨膜输运是由其氧化的亲水头部与疏水尾部协同完成的。

图2

图2   不同外力条件下Janus石墨烯量子点的生物膜内化过程

Fig.2   Membrane internalization of Janus graphene quantum dots under different external forces

为了探究不同拉伸强度条件下的Janus石墨烯量子点跨膜输运行为，图2（b）给出了Janus石墨烯量子点与细胞膜质心距离随时间演化曲线。Janus石墨烯量子点呈现特殊的外力依赖性跨膜行为：当拉伸强度小于600.0 kJ/(mol·nm)时，质心距离曲线有所下降但不明显，Janus石墨烯量子点并没有成功嵌入细胞膜中；当拉伸强度大于800.0 kJ/(mol·nm)，质心距离曲线在5.0 ns的初始阶段迅速下降，进而逐渐呈现动态平衡，最终Janus石墨烯量子点成功嵌入细胞膜中。此外，为了分析动力学过程的分子热力学变化规律，还记录了Janus石墨烯量子点与细胞膜间的能量变化曲线。图2（c）为分子间范德华作用能量曲线，该曲线下降趋势与质心距离曲线呈现相同的外力依赖性变化规律，当拉伸强度大于800.0 kJ/(mol·nm)时，分子间范德华作用能量曲线显著下降，进而避免了高的跨膜能垒。图2（d）为分子间的静电相互作用能量曲线，与范德华作用能量曲线相比，静电相互作用能量曲线并没有呈现明显的外力依赖性变化。当拉伸强度为200.0 kJ/(mol·nm)时，范德华作用能量呈现最低的状态，而拉伸强度大于200.0 kJ/(mol·nm)时，范德华作用能量下降却不明显。这主要是由于在不同拉伸强度条件下Janus石墨烯量子点在细胞膜表面发生着不同吸附形式，进而诱导不同的跨膜输运行为造成的，结果如图3所示。在低的拉伸强度条件下[≤200.0 kJ/(mol·nm)]，Janus石墨烯量子点在细胞膜表面呈现平躺式吸附构型，如图3（a）所示。而当拉伸强度增加[如为1200.0 kJ/(mol·nm)]，Janus石墨烯量子点嵌入细胞并呈现纵向摄入状态，如图3（b）所示。此外，平躺式吸附、纵向摄入均会造成细胞膜呈现异质性结构分布，进而诱导不同程度的细胞毒性。

图3

图3   Janus石墨烯量子点在生物膜中的结构表征

Fig.3   Structural characterizations of Janus graphene quantum dots in biomembrane

2.2 亲水-亲油平衡调控跨膜行为

图2观测到Janus石墨烯量子点的跨膜输运是由其亲水头部与疏水尾部协同控制的，对此进一步探究不同氧化程度对Janus石墨烯量子点跨膜输运的影响。拉伸强度为600.0 kJ/(mol·nm)时，不同氧化程度下的Janus石墨烯量子点跨膜输运结果如图4所示。尽管拉伸强度由原来的800.0 kJ/(mol·nm)降至600.0 kJ/(mol·nm)，仍能观察到不同的细胞膜摄取过程。图4（a）表明，随着氧化程度的增加，Janus石墨烯量子点进入细胞膜需要的动力学时间也逐渐增加。传统的氧化石墨烯氧化程度高，跨膜能垒也高，因此未观测到传统的氧化石墨烯成功嵌入细胞膜中。在热力学分析方面，图4（b）、（c）表明，随着氧化程度的增加，分子间范德华相互作用能量也增加，而分子间静电相互作用能量降低。这是因为随着氧化程度的增加，Janus石墨烯量子点的疏水比表面面积降低、亲水特性增加，进而导致各项能量变化。比较分子间范德华、静电相互作用能量可以发现，分子间范德华相互作用能量始终低于静电相互作用能量，即Janus石墨烯量子点的跨膜驱动力主要来源于Janus石墨烯量子点及磷脂双分子层尾部的疏水缔合作用。对于氧化石墨烯，尽管分子间范德华相互作用能量较Janus石墨烯量子点高，但分子间静电相互作用能量却很低，这与其在细胞膜表面的吸附形态有关。如图4（d）所示，Janus石墨烯量子点都成功实现跨膜输运，而氧化石墨烯平躺式吸附在细胞膜表面。特别地，可以观测到磷脂双分子层表面的极性部分通过静电相互作用牢牢地使氧化石墨烯表面的氧化官能团粘黏在细胞膜表面。此外，分析图4（d）可以发现，Janus石墨烯量子点以亲水头部朝向溶剂，疏水尾部纵向嵌入细胞膜内部而被细胞膜摄取。因此可以推断，石墨烯的亲水部分可以强化其在细胞膜表面的粘黏，而疏水部分可以降低跨膜能垒增进细胞膜摄取。

图4

图4   不同氧化程度的方形异质氧化Janus石墨烯量子点的生物膜内化过程

Fig.4   Membrane internalization of heterogeneously square-shaped oxidized Janus graphene quantum dots with various oxidation degrees

2.3 异质空间分布对跨膜输运的影响

进一步对比三角形、方形异质氧化空间分布对Janus石墨烯量子点的跨膜输运行为的影响。在施加拉伸强度为600.0 kJ/(mol·nm)条件下，三角形异质氧化的Janus石墨烯量子点跨膜输运结果如图5所示。如图5（a）所示，中等氧化程度（12.27%）的Janus石墨烯量子点需要近190.0 ns的动力学时间才能成功迁移至细胞膜表面与其粘黏；但只有氧化程度高的Janus石墨烯量子点才能成功被细胞膜摄取。如图5（b）、（c）所示，氧化程度低的Janus石墨烯量子点在细胞膜表面发生吸附，并观测到分子间范德华相互作用能量较高，而分子间静电相互作用能量较低。虽然氧化程度高的Janus石墨烯量子点成功嵌入细胞膜中，三角形异质氧化分布导致的能量曲线却高于方形异质氧化分布。这是因为Janus石墨烯量子点在细胞膜内的嵌入路径差异导致的，如图5（d）所示。三角形异质氧化分布使得Janus石墨烯量子点与细胞膜形成较长的接触线，进而增加了Janus石墨烯量子点的溶剂可及面积[图5（e）]，高的溶剂化效应额外增加了跨膜能垒。与图2相比，降低拉伸强度后，三角形异质氧化的Janus石墨烯量子点由于高的能垒很难实现跨膜。重要的是，对于三角形异质氧化分布的Janus石墨烯量子点，低的氧化程度有利于细胞膜对其成功摄取，而较高氧化程度的Janus石墨烯量子点却呈现半跨膜状态。与方形异质氧化分布的Janus石墨烯量子点相比，三角形异质氧化分布更能降低跨膜输运能垒。

图5

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图5   不同外力条件下三角形异质氧化Janus石墨烯量子点的生物膜内化过程

Fig.5   Membrane internalization of heterogeneously triangle-shaped oxidized Janus graphene quantum dots under different external forces

3 结论

从空间异质结构设计出发，构建了一系列不同氧化程度与空间异质分布的Janus石墨烯量子点，采用拉伸分子动力学模拟研究了Janus石墨烯量子点跨膜输运行为。结果表明Janus石墨烯量子点跨膜输运是由其氧化的亲水头部与疏水尾部协同决定的，Janus石墨烯量子点首先利用其极性亲水头部通过静电相互作用吸附在细胞膜表面，进而借助于疏水尾部与磷脂双分子尾链间的疏水缔合作用实现跨膜输运。由于溶剂化效应，氧化程度的增加会增高其跨膜能垒，与三角形异质氧化分布相比，方形异质氧化分布的Janus石墨烯量子点可以降低溶剂化效应，更容易被细胞膜摄取。