对甲基苯磺酸预处理玉米秸秆动力学及酶解特性研究

玉米秸秆（全秆）产地为陕西省定边县。对甲基苯磺酸一水合物（p-TsOH∙H₂O，质量分数99.0%）、四环素、柠檬酸、柠檬酸钠均购于阿拉丁试剂公司。纤维素酶（C2730）购于诺维信公司，采用滤纸酶活法^[10]测定酶活为160 FPU/g。

p-TsOH预处理玉米秸秆工艺中的3个预处理因素具体实验条件为：p-TsOH质量分数10%~70%，水解温度35~95℃，水解时间20~100 min。具体的预处理条件按照表1中设计以进行实验。

预处理实验：将200 mL 质量分数10%的p-TsOH溶液加入500 mL锥形瓶后置于恒温水浴锅中，待溶液温度达到预定值后，搅拌速率设定为300 r/min，将研磨后10 g（绝干）玉米秸秆粉末加入锥形瓶中，并开始计时。到达预定水解时间后，趁热使用G2砂芯滤器进行真空抽滤，收集滤出水解液，使用大量蒸馏水洗涤预处理后残渣至洗涤液为中性。取少量预处理后残渣分别进行冷冻干燥（-50℃，48 h）和真空干燥（45℃，24 h）。水解液中溶解的木质素通过稀释沉淀法回收利用、p-TsOH通过减压蒸馏结晶后回用，而水解液中的半纤维素降解产物（如戊糖和糠醛等）通过膜过滤分离法回收^[10-12]。

预处理后玉米秸秆三大组分含量发生了变化，进一步研究了预处理后不同组分含量的玉米秸秆残渣的酶解可及性，具体酶解工艺^[13]为：将经冷冻干燥的50 mg（绝干）预处理后玉米秸秆残渣、800 µg四环素依次加入空气摇床中的30 mL锥形瓶里，计算并加入适量的pH值=4.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液使得最终酶水解反应体系溶液总体积为10 mL。升温至50℃后，加入15 FPU/g（以纤维素质量计）的纤维素酶解液并开始计时，摇床转速为200 r/min，酶解时间为72 h。反应结束后，将酶解锥形瓶置于沸水中并保持5 min，使纤维素酶失活。灭活后的酶解液在4000 r/min下离心5 min，上清液中葡萄糖浓度通过生物传感分析仪（SBA-40D，山东省科学院生物研究所）测量。纤维素酶解得率按式（1）计算。

不同预处理工艺后玉米秸秆残渣的三大组分含量见表1。由表1可知，p-TsOH预处理对玉米秸秆三大组分影响较大：当p-TsOH质量分数、水解温度和水解时间3个因素其中之一不断增大时，预处理后残渣中半纤维素含量和木质素含量均随之降低；纤维素含量则不断增加。木质素含量从初始18.9%下降至最低3.4%，半纤维素含量从初始21.6%下降至最低6.6%，纤维素含量从初始40.5%增至最高77.4%。

随着p-TsOH质量分数的增加，木质素和半纤维素保留率逐渐降低，在p-TsOH质量分数为70%时，木质素和半纤维素的保留率分别为7.7%和18.0%，这与前人的研究结果一致^[19]。这可能是因为随着p-TsOH质量分数增加，其对半纤维素的降解作用加强。同时由于p-TsOH具有表面活性剂的结构特性，形成了大量胶束使得木质素的溶解度增加^[6]。其中，木质素保留率在p-TsOH质量分数为50%时出现转折。p-TsOH质量分数从10%增加至50%，木质素保留率快速降低，p-TsOH质量分数从50%增加至70%，木质素保留率的降低变得平缓。这说明当p-TsOH质量分数超过50%后，继续增加p-TsOH质量分数对木质素脱除率的提高效率降低。因此，选择p-TsOH质量分数50%较为适宜。随着预处理p-TsOH质量分数增加，纤维素保留率基本保持不变，在81%左右波动。这说明p-TsOH质量分数对纤维素的降解没有明显影响，这有利于预处理过程中纤维素组分的保留。

随着水解时间从20 min增加至100 min，纤维素、半纤维素和木质素保留率变化均不大，分别在82%、23%和14%左右波动。这可能是因为p-TsOH对非木质纤维素的水解反应速率较快，在较短的处理时间内即可完成主要水解反应。

水解温度对木质素和半纤维素保留率的影响较大，而对纤维素保留率的影响较小。当水解温度从35℃升至95℃时，木质素和半纤维素保留率分别降低至10.0%和13.0%，纤维素保留率为81.0%，这说明水解温度对木质素和半纤维素的脱除作用较明显，而对纤维素的降解作用较为有限。尽管升高温度会降解部分纤维素，但可以较大程度脱除半纤维素和木质素。然而，若将水解温度提高至100℃以上，则会超过溶液的沸点，需要使用压力容器，同时能耗更高。因此，综合考虑预处理效率、成本及安全性，采用最高水解温度95℃较为适宜。

进一步通过SIMCA软件^[20]系统分析了预处理因素对玉米秸秆中木质素和半纤维素脱除的影响，拟合分析结果如表2所示。3个因素对木质素和半纤维素的解释系数（˃0.85）和预测系数（˃0.5）都较高，说明拟合得到模型的解释和预测能力均较好。同时，拟合过多变量后预测系数开始下降，说明继续增加拟合变量可能会造成过拟合。当变量对因变量的重要性大于1时，则说明其对因变量的影响是显著的。可得出p-TsOH质量分数和水解温度对木质素的脱除有显著影响，水解温度对半纤维素的脱除有显著影响（见表2）。最终得到预处理后残渣中木质素含量（L_residue）和预处理后半纤维素的含量（H_residue）的回归方程分别见式（7）和式（8）。

式中，L_residue为预处理后残渣中木质素的含量，%；H_residue为预处理后半纤维素的含量，%；P为p-TsOH质量分数，%；T为水解温度，℃；t为水解时间，min。

综合分析可知，p-TsOH预处理可以同时脱除玉米秸秆中的木质素和半纤维素，而对纤维素组分的水解作用较弱（纤维素保留率大于80%）（见表1）。SIMCA软件分析结果可以解释部分信息并可以作为经验公式来预测实验结果，但此分析较为简单并且对于木质素和半纤维素在预处理过程中的降解和迁移过程不能给出很好的解释。因此，进一步通过两相模型，并引入CDF和CHF来研究p-TsOH预处理过程中玉米秸秆木质素和半纤维素的水解脱除过程。

为了研究预处理玉米秸秆中木质素和半纤维素脱除过程，基于前人研究结果，采用CDF和CHF来表述3个预处理因素对木质素脱除和半纤维素脱除过程的影响。

CDF计算见式（9）。

L_R计算见式（10）。

CHF计算见式（11）。

H_R计算见式（12）。

式中，L_R为木质素保留率，H_R为半纤维素保留率；θ和θ′分别为预处理过程中容易脱除的木质素和半纤维素占比；θ_R和θ′_R分别为预处理中不易脱除的木质素占比和半纤维素占比；f为木质素脱除快反应与慢反应的速率常数之比，f′为半纤维素脱除快反应与慢反应的速率常数之比；C为p-TsOH的摩尔浓度，mol/L；t为水解时间，min；R为气体常数，8.314 J/(mol∙K)；T为水解温度，K；α、α′、β和β′为可调参数；E和E′分别为木质素脱除反应和半纤维素脱除反应的表观活化能，J/mol。

将表1的实验数据代入上述模型中，求解得到各参数值见表3。结果表明，p-TsOH预处理玉米秸秆中较难脱除的木质素和半纤维素的比例较小（均小于25%）；木质素脱除反应活化能为66.5 kJ/mol，半纤维素脱除反应活化能为50.5 kJ/mol，这也说明p-TsOH预处理玉米秸秆的反应速率较快，且容易受到温度影响。

最终拟合得到预处理后残渣中木质素脱除的动力学方程见式（13）和式（14）。

预处理后残渣中半纤维素脱除的动力学方程见式（15）和式（16）。

玉米秸秆预处理后残渣中木质素保留率的实测值与理论值随CDF的变化一致，说明拟合得到的p-TsOH预处理玉米秸秆的木质素脱除模型较好（R²为0.9342，见图1（a））。木质素保留率随CDF的增大，表现为先迅速下降后缓慢下降；曲线在CDF值为1500 min∙mol/L处出现转折，0~1500 min∙mol/L属于快速脱木质素阶段；1500~15000 min∙mol/L属于慢反应阶段。

图1  p-TsOH预处理玉米秸秆的CDF和CHF曲线

Fig. 1  CDF and CHF curves of cornstalk pretreated by p-TsOH

玉米秸秆预处理后残渣中半纤维素保留率的实测值与理论值CHF的变化一致，说明拟合得到的p-TsOH预处理玉米秸秆的半纤维素脱除模型较好（R²为0.9027，见图1（b））。半纤维素保留率随CHF的增大，也呈现出先迅速下降后缓慢下降的趋势。曲线在CHF为100 min∙mol/L附近出现转折，当CHF<100 min∙mol/L时，半纤维素的保留率>33%，CHF>300 min∙mol/L时，半纤维素的保留率<23%。

为了考察p-TsOH预处理对玉米秸秆表面破坏情况，通过SEM观察了玉米秸秆和两种p-TsOH水解工艺（P50T65t40、P50T95t40）处理后残渣的表面微观形貌（见图2）。由图2可知，玉米秸秆表面较光滑，结构较为致密。通过温和条件（P50T65t40，CDF=947 min∙mol/L）预处理后，原料结构被打开，纤维开始初步解聚，表面被破坏并出现孔洞结构。在较为剧烈条件（P50T95t40，CDF=6513 min∙mol/L）处理后，原料结构被严重破坏，原料解离为小的纤维束，纤维表面变得粗糙。这说明随着预处理条件的加剧，非木质纤维原料的致密结构被破坏而变得松散，更多的纤维得以暴露，这些都有利于后续酶的接触和吸附。

图2  玉米秸秆经不同预处理工艺的FESEM图

Fig. 2  FESEM images of cornstalk by different pretreatment conditions

注   (a)、(d)玉米秸秆；(b)、(e) P50T65t40预处理后玉米秸秆残渣；(c)、(f) P50T95t40预处理后玉米秸秆残渣。

生物质的结晶指数对酶解有重要的影响^[21]。玉米秸秆的结晶指数为45.93%，p-TsOH预处理后玉米秸秆残渣的结晶指数均有所提高（见图3）。这主要归因于p-TsOH对半纤维素和木质素的脱除。随着p-TsOH质量分数升高，预处理后残渣的结晶指数有小幅的升高，在p-TsOH质量分数为70%时，结晶指数为68.91%。随着水解时间增加，预处理后玉米秸秆残渣的结晶指数没有明显变化。随着水解温度的升高，预处理后玉米秸秆残渣的结晶指数有明显提高（在95℃时结晶指数为66.85%）。P10T80t60预处理条件处理后残渣的结晶指数为62.86%，这说明在较高的水解温度、低p-TsOH质量分数预处理条件下，预处理后玉米秸秆残渣的结晶指数会有较大程度的升高。

图3  玉米秸秆经不同预处理工艺的XRD图

Fig. 3  XRD diagram of cornstalk by different pretreatment conditions

生物质的表面组成与其酶解可及性有密切联系，其中表面木质素含量影响纤维素酶在物料表面的结合，进而影响酶解性能^[22-23]。通过XPS测定了玉米秸秆和两种p-TsOH预处理工艺（P50T65t40、P50T95t40）处理后玉米秸秆残渣的表面组成（见图4）。

图4  玉米秸秆经不同预处理工艺的C分峰谱图

Fig. 4  Deconvolution of C spectra of cornstalk by different pretreatment conditions

生物质物料表面的碳化学键可以分为4种类型（C1、C2、C3、C4）^[24]，其中C1对应于C—C和C—H键，主要对应于木质素^[24]；C2对应于C—O，主要对应于纤维素^[24]。玉米秸秆C1峰较强，对应峰面积占比为54.8%，而C2峰相对较弱，其峰面积占比为36.8%（见图4（a）），说明玉米秸秆表面木质素含量较高，纤维素含量较低。随着预处理条件加剧，C1峰逐渐减小，C2峰逐渐增强，P50T95t40预处理后残渣的C1峰面积占比为35.7%，C2峰面积占比为50.7%，说明经过预处理后玉米秸秆残渣表面木质素含量降低（见图4（c））。

经计算玉米秸秆中表面木质素含量为81.87%，经过p-TsOH预处理后表面木质素含量降低，经温和预处理工艺（P50T65t40，CDF=947 min∙mol/L）处理后玉米秸秆残渣表面木质素含量为66.6%，经较为剧烈预处理工艺（P50T95t40，CDF=6513 min∙mol/L）处理后玉米秸秆残渣表面木质素含量为38.6%。随着预处理程度的增加，表面木质素含量迅速减少，这有利于后续酶对纤维素的有效吸附。

玉米秸秆水解残渣的酶解糖化是实现木质纤维分级转化高效利用的重要途径^[25]。未处理玉米秸秆的酶解得率较低，仅为26.6%（见图5（b）），而p-TsOH预处理后玉米秸秆残渣酶解得率均有大幅度提高，这说明p-TsOH预处理是提高玉米秸秆酶解得率的有效方法。

图5  p-TsOH质量分数、水解时间和水解温度对预处理后玉米秸秆残渣酶解得率的影响

Fig. 5  Effects of p-TsOH mass fraction, hydrolysis time and hydrolysis temperature on the enzymatic yield of hydrolyzed cornstalk residual

酶解得率随预处理p-TsOH质量分数的增加而增加（见图5（a））：p-TsOH质量分数从10%增加至30%，玉米秸秆残渣酶解得率增加缓慢；p-TsOH质量分数从30%增加至50%，玉米秸秆残渣酶解得率增加较快；p-TsOH质量分数从50%增加至70%，玉米秸秆残渣酶解得率增加变缓。在p-TsOH质量分数为70%时，酶解得率为71.9%。这是由于随着p-TsOH质量分数的增加，p-TsOH对非木质纤维的破坏作用增强，更多的纤维素得以暴露，有利于纤维素与酶的接触。低的p-TsOH质量分数对木质素脱除作用较为有限，而过高的p-TsOH质量分数对设备腐蚀作用较大，同时高的p-TsOH质量分数预处理后水解液中溶解的木质素在分离时需要消耗更多的水。因此，选择p-TsOH质量分数50%进行后续酶解实验。

延长预处理水解时间，酶解得率变化不大，保持在63%左右，这与水解时间对木质素脱除效果结果一致（见表1）。提高水解温度，玉米秸秆残渣的酶解得率增加明显，从35℃时的34.9%增加至95℃时的72.9%。这可能是因为水解温度升高，木质素保留率减少。由图5（a）和图5（c）可知，继续增加p-TsOH质量分数或提高水解温度，酶解得率可以进一步提升。