传统工艺下发酵时间对大河乌猪火腿挥发性风味物质的影响

大河乌猪是云南省首次育成的生产优质肉和优质干腌火腿的兼用型猪种，以肉质优良、营养丰富、风味独特著称[1]。风味是火腿最重要的质量指标之一[2]，发酵是火腿风味形成的关键阶段[3]，已有大量关于火腿发酵过程中挥发性风味物质的研究。郑璞等[4]发现盘县火腿在发酵过程中挥发性风味物质的种类增加了15种，其中醛类物质的种类和含量最丰富；王嫒嫡[5]发现随着发酵时间的延长，宣威火腿的特征性风味物质含量增加，风味趋好；谭椰子等[6]对不同年份金华火腿、浦记火腿和如皋火腿进行分析鉴定，共检出62种挥发性风味化合物，其中15种(醛类10 种)化合物具有较高的气味活度值，对火腿风味有较大贡献；GIOVANELLI等[7]比较了帕尔马、圣丹尼和托斯卡诺火腿发酵过程中理化、形态和芳香特征的演变，发现随着加工时间延长，火腿风味物质更丰富，香气明显改善。然而，目前有关大河乌猪火腿挥发性风味物质的研究较少。

传统干腌火腿属于自然发酵肉制品，通常是按季节、气候控制生产时间，传统工艺条件即在自然条件下对火腿进行冷凉后熟、修割整形、上盐腌制等加工，经过脱水平衡，最后发酵产香得到成熟火腿。本研究以传统工艺条件下生产的大河乌猪火腿为研究对象，研究发酵时间(90、150、210、270、450、630 d)对火腿挥发性风味物质的影响，以期为大河乌猪火腿的风味品质及形成机理的研究奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大河乌猪火腿(10±1)kg，云南东恒经贸集团有限公司。

1.2 仪器与设备

固相微萃取装置及SPME萃取头(50/30 μm DVB/CAR/PDMS)，美国Supelco公司；7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent公司；JJ-2BS组织捣碎机，常州峥嵘仪器有限公司；超低温冰箱，上海艾本德国际贸易有限公司；透明顶空萃取瓶(20 mL)，上海安谱科学仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 大河乌猪火腿的生产工艺

大河乌猪火腿的生产工艺如下：

172只新鲜后腿→冷凉后成熟18 h→修割整形→上盐腌制21 d→脱水平衡60 d→发酵产香90～630 d→成熟火腿

1.3.2 火腿采样

从发酵时间为90、150、210、270、450、630 d的6个组中分别随机抽取4只火腿，共计24只火腿，将半膜肌和股二头肌按1∶1的质量比混合，组织捣碎机搅碎后真空包装并保存在-20 ℃备用，每个发酵周期结束后立即对样品进行测定。

1.3.3 挥发性风味物质萃取及GC-MS条件

顶空固相微萃取条件：参照HUAN等[8]的方法，称取肉样5.00 g于20 mL顶空瓶中；将老化后的50/30 μm萃取头插入顶空瓶上部，于50 ℃吸附40 min，吸附后的萃取头取出后插入GC进样口，于210 ℃解析5 min，同时启动仪器采集数据。

GC-MS参数参考郇延军等[9]和等[2]的方法并稍作修改。GC条件:色谱柱：DB-5 MS毛细色谱柱(30 m × 0.25 mm，0.25 μm)；升温程序：40 ℃保持5 min，以5 ℃/min升至90 ℃，再以12 ℃/min 升至250 ℃并保持7 min；载气He(纯度≥99.999%)；流速1.0 mL/min；进样口温度250 ℃；进样量0.5 μL；分流比1∶30。

MS条件:传输线温度280 ℃，离子源EI，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，电子能量70 eV，质量扫描范围(m/z)50～450。

1.3.4 挥发性风味物质的鉴定

参照王勇勤等[10]和高韶婷等[11]的方法对挥发性物质进行定性和定量分析。

挥发性物质的定性：将测得各挥发物的谱图与NIST 2008和Wiley 9 谱库中标准物质的谱图进行比对，仅报道正反匹配度均大于800(最大值为1 000)的结果；同时计算各挥发物的保留指数(retention index，RI)并与文献中的RI进行比对，RI的计算如公式(1)所示：

(1)

式中：Rt(x)、Rt(n)及Rt(n+1)分别为待测挥发性成分、含n个碳原子正构烷烃及n+1个碳原子正构烷烃的保留时间，min。

挥发性物质的定量：采用峰面积归一化法。

1.3.5 关键挥发性物质评定方法[12]

采用相对香气活度值法(relative odor activity value，ROAV)，计算如公式(2)所示：

(2)

式中：ROAVi为某挥发性风味物质的相对气味活度值；Ci为某挥发性风味物质的相对含量；Tstan为气味贡献最大挥发性风味物质的阈值；Cstan为气味贡献最大挥发性风味物质的相对含量；Ti为某挥发性风味物质的阈值。

1.4 数据分析

采用Microsoft Excel 2010以峰面积归一化法，计算各挥发性化合物的相对含量，结果输出形式以x±s计。SIMCA14.1进行偏最小二乘-判别分析(partial least squares discrimination analysis，PLS-DA)。

2 结果与分析

2.1 大河乌猪火腿发酵过程中挥发性化合物的变化

大河乌猪火腿在发酵过程中挥发性风味成分变化见表1和表2，发酵过程中共鉴定到135种挥发性化合物，6个发酵期(90、150、210、270、450和630 d)挥发性风味物质种类分别为51、37、53、57、58、73种，包括醛、醇、烃、酸、酮、酯及其他类化合物，它们的变化初步反映了火腿风味的形成过程。

大河乌猪火腿6个发酵期共检测到18种醛类物质，且相对含量呈先增加后降低的变化趋势，醛类是大河乌猪火腿每个发酵阶段相对含量最多的一种成分。研究发现，醛类化合物主要是脂质降解以及亮氨酸与异亮氨酸Strecker降解生成的，醛类物质含量高且风味阈值较低，在火腿风味中起着至关重要的作用[13]；SABIO等[14]发现，Bayonne、Corsican、Iberian、Parma和Serrna火腿中的醛类物质在挥发性风味成分中占比达50%以上；要萍等[15]发现醛类物质是宣威火腿中最丰富的挥发性风味物质，与本研究结果类似。

醇类化合物阈值较高，因而对风味的贡献度不高[16]。在大河乌猪火腿的整个发酵过程中，醇类物质相对含量在11.25%～16.60%变化，发酵至210 d时相对含量最丰富。其中，1-辛烯-3-醇是大河乌猪火腿每个发酵期相对含量最丰富的醇类，1-辛烯-3-醇又称蘑菇醇，具有蘑菇香味，通常是肉制品最丰富的醇类，在Iberico干腌火腿中较为常见[17]。

大河乌猪火腿不同发酵期共鉴定得到33种烃类物质，发酵至630 d时种类最丰富，共检测出20种。高韶婷等[11]在金华火腿中共检测到6种烃类物质，与其相比，大河乌猪火腿中的烃类物质较多，但由于烃类物质的阈值较大，对风味的贡献率几乎可以忽略不计。

酯类物质代表成熟肉制品的风味，阈值较低，对火腿风味贡献较大[18]。大河乌猪火腿中共检测出14种酯类物质，发酵至90 d时相对含量(11.32%)最丰富，发酵至450 d时检测出1种内酯类物质(γ-丁内酯)，内酯类物质对火腿的风味具有重要的作用，赵冰等[19]检测出γ-己内酯、γ-丁内酯为特级金华火腿中的特征风味物质。

酮类化合物一般具有奶香或果香味，是火腿香气的重要组成部分[20]。大河乌猪火腿6个发酵阶段酮类物质相对含量和种类不断变化，共检测到15种酮类物质。酮类物质作为一种羰基化合物，它的相对含量比醛类少，阈值也比同分异构体的醛类物质高[21]，因此对干腌火腿风味的贡献小于醛类，但有增强风味的作用。

酸类化合物可能来自于火腿中磷脂和总三酯酰甘油的降解，其阈值较高，对食品风味没有直接的影响[25]，大河乌猪火腿发酵成熟过程中共检测到10种酸类物质，相对含量在0.36%～6.14%，发酵150 d时相对含量最丰富。要萍等[15]在宣威火腿中只有检测到1种酸类物质；郑璞等[4]发现，盘县火腿在成熟过程中共检测到7种酸类物质，酸类物质含量呈上升趋势，与本研究结果不同，可能是由于工艺和猪肉品种引起的差异。

大河乌猪火腿中其他类共检测出22种，包括芳香族类和一些杂环化合物，芳香族类物质同烷烃类一样具有较高的阈值，对火腿风味贡献较小[13]，杂环化合物是美拉德反应的典型产物，可赋予肉制品强烈的肉香味，是干腌火腿中重要的挥发性风味物质[22]。

表1 发酵过程中火腿挥发性风味成分
Table 1 Volatile flavor components during fermentation of ham

续表1

续表1

注：-表示未检出该物质；相对含量计算方法(峰面积归一化法)：每只火腿所测得所有成分的峰面积相加得到总面积，用单个成分的峰面积除以总面积，即得到各成分的相对含量(下同)

表2 火腿发酵过程中挥发性风味成分的种类及相对含量
Table 2 Composition and relative contents of volatile flavor compounds during the fermentation of ham

2.2 PLS-DA发酵时间对大河乌猪火腿挥发性风味物质的影响

PLS-DA结果如图1所示，累计 R2X=0.813，R2Y=0.927，Q2=0.766，Hotelling图显示(图2)所有样品均处于95%Hotelling T2置信区间内，没有发现“离群样本点”，说明该模型有较好的预测能力。从样本的聚集、离散程度看来，发酵90、150 d的样本分别聚集在不同的象限，而发酵至210、270、450、630 d的样本聚集在一起，说明这4个时期挥发性风味物质的组成相似，主体风味成分在发酵至210 d就已基本形成，该结果与SHI等[23]研究的腌制24 d发酵90～630 d的大河乌猪火腿类似。

图1 发酵过程中挥发性风味成分PLS-DA得分图
Fig.1 PLS-DA score plot of volatile flavor components during fermentation

图2 发酵过程中挥发性风味成分Hotelling T2 分布图
Fig.2 Hotelling T2 value range plot of volatile flavor component during fermentation

2.3 ROAV分析发酵时间对大河乌猪火腿关键风味物质的影响

如表3所示，大河乌猪火腿的关键风味化合物(ROAV≥1)有17种：己醛、庚醛、辛醛、壬醛、2-辛烯醛、(Z)-6-壬烯醛、(E)-2-壬烯醛、3-甲基丁醛、苯乙醛、(E)-2-癸烯醛、2，3-辛二酮、3-羟基-2-丁酮、1-辛烯-3-醇、庚醇、芳樟醇、愈创木酚、2-戊基呋喃，与金华火腿和伊比利亚火腿的关键风味化合物类似[24-25]。在发酵的6个时期火腿的关键风味化合物(ROAV≥1)种类分别为11、8、9、10、12、15种，除了未查到阈值的化合物，在大河乌猪火腿成熟的6个发酵时期中，ROAV最大的均为醛类，已有研究证明，醛具有较低的气味阈值，对干腌火腿的整体风味起着重要作用[12,26]。

由表3可知，发酵至90 d，火腿中ROAV较大的是壬醛、辛醛和(Z)-6-壬烯醛；发酵至150 d，火腿中ROAV较大的是3-甲基丁醛、己醛和1-辛烯-3-醇；发酵210、270、450、630 d，火腿中ROAV较大物质均为辛醛、壬醛和1-辛烯-3-醇，表明从发酵210 d开始对大河乌猪火腿风味贡献较大的风味物质相同，与PLS-DA得到的结果类似，再次说明发酵至210 d时主体风味物质已形成。

表3 火腿发酵过程中挥发性成分气味贡献表
Table 3 Odor contribution of volatile components during fermentation of ham

注：气味阈值来自文献[27-28]；表中仅列出ROAV≥0.1的物质

3 结论

大河乌猪火腿发酵过程中共鉴定到135种挥发性风味成分，包括醛、醇、酸、烃、酮、酯及其他类化合物。发酵210、270、450、630 d大河乌猪火腿中挥发性风味物质组成相似，说明发酵210 d火腿的主体风味物质已基本形成，大河乌猪火腿的加工期可定为10～12个月；发酵过程中火腿的关键风味物质有己醛、庚醛、辛醛、壬醛、2-辛烯醛、(Z)-6-壬烯醛、(E)-2-壬烯醛、3-甲基丁醛、苯乙醛、(E)-2-癸烯醛、2，3-辛二酮、3-羟基-2-丁酮、1-辛烯-3-醇、庚醇、芳樟醇、愈创木酚、2-戊基呋喃等17种。研究为大河乌猪火腿特征风味物质的确定及挥发性风味物质形成机理研究奠定一定基础。