茶花蜂花粉酸羊乳发酵和冷藏期间品质及抗氧化活性研究

羊乳是一种重要的大宗乳产品，营养丰富、易消化吸收、低致敏且具有多种保健功效，被誉为“乳中之王”。随着消费者对羊乳营养及保健价值的认可，羊乳产业进入高速成长期，然而目前市场上羊乳制品品种单一，以羊乳粉占据主导地位，新产品开发滞后，严重制约了羊乳产业的发展。功能性酸羊乳近年来备受国内外学者关注，红枣汁[1]、蜂蜜[2]、枸杞浆[3]等多种天然健康食品原料被添加到羊乳中以开发新型保健酸乳，成为开展羊乳产品创新的重要途径。

蜂花粉享有“完全营养素”美誉，含有11%～35%蛋白质、20%～39%碳水化合物、1%～20%脂质，同时含酚类、黄酮、多肽、磷脂和甾醇等生物活性成分，具有抗氧化、增强免疫力、降血糖、护肝等功效，是开发功能性食品的热点原料[4-8]。有学者分别利用油菜和茶花蜂花粉研究保健酒和发酵型蜂花粉酱[5-6]；KHIDER等[7]将埃及玉米、三叶草、海枣蜂花粉应用于酸牛乳开发；KARABAGIAS等[8]则发现埃及复合蜂花粉添加对牛、山羊、绵羊不同种类酸乳感官品质及抗氧化活性带来明显差异。蜂花粉和乳制得的发酵乳制品不仅具有酸乳独特的风味和口感，而且包含蜂花粉中活性物质，同时微生物发酵作用也会有效降低蜂花粉致敏成分，产品更兼具营养和保健特色。然而，目前有关蜂花粉酸乳研究整体还比较匮乏，尤其缺乏中国特色蜂花粉应用于酸羊乳产品开发的报道。此外，蜂花粉中富含的多酚、黄酮类活性成分易受pH、光照、温度及氧等环境因素影响而发生不稳定现象，其浓厚的花粉口感及气味也难以让消费者接受[1,9]。研究表明，β-环状糊精(β-cyclodextrin，β-CD)、乳清蛋白、海藻酸钠等物质因特殊疏水空腔结构、良好成膜性或离子凝胶化形成微胶囊囊壁而具有包埋保护作用，可有效提高敏感活性成分稳定性并掩盖不良风味和色泽，在黑米花青素、苦荞黄酮、杨梅酚酸提取物等产品开发中得到广泛应用[10-12]。包埋保护剂处理蜂花粉对酸乳口感及生物活性的影响也有待研究。

因此，本文以中国特色茶花蜂花粉为原料，采用机械破壁-超声水提法制备提取物并添加到羊乳中开发蜂花粉发酵酸羊乳，研究茶花蜂花粉添加以及β-CD保护剂处理蜂花粉对酸羊乳感官、滴定酸度、pH、乳酸菌活菌数、持水力、质构特性以及体外抗氧化指标的影响，并探究产品冷藏期间品质和抗氧化活性动态变化，以期为开发功能性蜂花粉酸羊乳，促进羊乳及蜂花粉资源开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

生鲜羊乳，宝鸡众羊生态牧业有限公司；YF-L812乳酸菌发酵剂，丹麦科汉森公司；茶花蜂花粉，湖北仙桃蜂农提供；β-CD，孟州市华兴生物化工有限责任公司；蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉、琼脂粉，北京奥博星生物技术责任有限公司；甲醇、FeCl3、FeSO4，天津市科密欧化学试剂有限公司；2,2-二苯基-1-苦基-肼基、2,4,6-三吡啶基三嗪、菲洛嗪，Sigma-Aldrich公司。

1.2 仪器与设备

KQ-250DE超声仪，昆山市超声仪器有限公司；RE-3000B旋转蒸发仪，西安太康生物科技有限公司；FD-1C-50冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司；Five Easy Plus pH计，梅特勒-托利多仪器有限公司；TGL-20bR冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；TA.XT plus C质构仪，英国Stable Micro System公司；722G可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司；DHP-9162电热恒温培养箱，上海齐欣科学仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 茶花蜂花粉提取物的制备

采用机械破壁-超声水提法制备。茶花蜂花粉经机械粉碎后按料液比1∶20(g∶mL)加入去离子水，65 ℃超声辅助提取1.5 h，后4 000 r/min离心15 min，收集上清液于50 ℃真空旋转蒸发成浸膏状，再经真空冷冻干燥制得水提物冻干粉。经测定，茶花蜂花粉水提物含有蛋白质3.78 g/100 g、总糖68.47 g/100 g、脂肪1.18 g/100 g、总酚6.49 mg/g、黄酮2.24 mg/g。

取一定量茶花蜂花粉冻干粉按料液比2∶3(g∶mL)加去离子水溶解，然后按1∶1(质量比)称取β-CD保护剂并配制成25 mg/mL β-CD溶液，两者于50 ℃下800 r/min磁力搅拌混合40 min，然后10 000 r/min高速分散1 min，再经真空冷冻干燥得到β-CD-茶花蜂花粉冻干粉。

1.3.2 酸羊乳样品的制备

(1)酸羊乳(对照，记为Y0)

羊乳(预热至60 ℃)→添加白砂糖(7%，质量分数)→均质(60～65 ℃，一级20 MPa，二级5 MPa)→杀菌(90～95 ℃，5 min)→冷却(40～45 ℃)→接种(0.2 U/kg乳)→发酵(43 ℃)→后熟24 h(4 ℃)→成品。

(2)茶花蜂花粉酸羊乳

羊乳(预热至60 ℃)→添加白砂糖(7%，质量分数)、茶花蜂花粉冻干粉(按质量分数1%、2%、3%添加)→均质(60～65 ℃，一级20 MPa，二级5 MPa)→杀菌(90～95 ℃，5 min)→冷却(40～45 ℃)→接种(0.2 U/kg乳)→发酵(43 ℃)→后熟24 h(4 ℃)→成品。

(3)β-CD-茶花蜂花粉酸羊乳

羊乳(预热至60 ℃)→添加白砂糖(7%，质量分数)→均质(60～65 ℃，一级20 MPa，二级5 MPa)→添加β-CD-茶花蜂花粉冻干粉(按茶花蜂花粉提取物干重计，按质量分数1%、2%、3%添加，分别记为YB1、YB2、YB3)→混匀→杀菌(90～95 ℃，5 min)→冷却(40～45 ℃)→接种(0.2 U/kg乳)→发酵(43 ℃)→后熟24 h(4 ℃)→成品。

1.3.3 感官评价

酸羊乳从冰箱取出后室温放置30 min回温，感官评定小组参考GB 19302—2010《食品安全国家标准 发酵乳》从色泽、风味、口感、组织状态4方面对其进行评价，评分标准见表1。

表1 茶花蜂花粉酸羊乳感官评价标准
Table 1 Sensory evaluation standard of goat milk yogurt added Camellia sinensis bee pollen

1.3.4 滴定酸度和pH测定

参照GB 5009.239—2016《食品安全国家标准 食品酸度的测定》测定酸羊乳滴定酸度；室温条件下使用pH计测定酸羊乳pH。

1.3.5 乳酸菌数测定

参照GB 4789.35—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验》对酸羊乳中保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌进行培养计数(CFU/mL酸乳)。

1.3.6 持水力测定

参考文献[13]的方法测定酸羊乳持水力。

1.3.7 质构特性测定

参照实验室建立的酸羊乳质构特性检测方法[13]对酸羊乳硬度、稠度、内聚性和黏性指数进行测定，采用单次下压测试，探头选择A/BE-40。

1.3.8 体外抗氧化活性测定

参照实验室建立的酸羊乳体外抗氧化活性评价方法[13]对样品进行稀释并测定其DPPH自由基清除能力、FRAP总抗氧化能力及Fe2+螯合能力。

1.3.9 数据处理与分析

实验重复3次，数据以平均值±标准偏差表示，采用SPSS 19.0软件进行显著性分析，P<0.05认为存在差异显著。

2 结果与分析

2.1 茶花蜂花粉添加对酸羊乳感官品质的影响

由表2可知，适量添加茶花蜂花粉(1%、2%)可有效提高酸羊乳感官品质，但添加量增至3%，酸羊乳色泽变深且不均匀，茶花蜂花粉气味过浓，乳香味被掩盖，口感变差，感官评分下降；而茶花蜂花粉经β-CD处理后，酸羊乳色泽、风味、口感指标显著高于未处理组。β-CD具有葡萄糖分子环状联结而成的亲水表面和疏水中心结构，经其处理会有效掩盖茶花蜂花粉不良气味及色素成分，赋予产品更佳的感官品质[14]。孙亚利[11]研究发现，与游离苦荞黄酮酸乳相比，苦荞黄酮经聚合乳清蛋白处理后同样可有效遮盖苦味及颜色，提高产品感官特性。

表2 茶花蜂花粉添加对酸羊乳感官品质的影响
Table 2 Effects of C. sinensis bee pollen addition on sensory quality of goat milk yogurt

注：上标不同小写字母表示同一行酸羊乳间存在显著差异(P<0.05)(表3同)

2.2 茶花蜂花粉添加对酸羊乳酸度、乳酸菌数、持水力、质构特性及抗氧化活性的影响

由表3可知，茶花蜂花粉添加显著提高酸羊乳酸度，且随蜂花粉添加比例增大酸度持续升高，这表明茶花蜂花粉水提物可有效促进乳酸菌发酵产酸。ELENANY等[2]研究发现马郁兰蜂蜜添加同样可提高酸羊乳滴定酸度，认为蜂蜜中葡萄糖、果糖等成分促进了乳酸菌的发酵作用；YEKTA等[15]研究则表明红枣多糖益生元特性可提高乳酸菌产酸性能。蜂花粉水提物中富含葡萄糖、果糖、寡糖和多糖等糖类成分，从而提高了乳酸菌生长和代谢活性[16]。此外，β-CD-茶花蜂花粉酸羊乳的酸度均略低于未处理组，β-CD处理在一定程度上降低产品发酵酸度(表3)，这可能与蜂花粉水提物组分被β-CD包裹影响了乳酸菌对营养物质的利用有关。

茶花蜂花粉添加使酸羊乳中保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌数有所减少，且添加比例愈大乳酸菌数量减少愈显著(表3)。FENG等[1]也发现红枣酸羊乳中乳酸菌数量减少程度与红枣汁添加量呈正相关，其认为红枣汁中天然酸度和酚类物质抑制了乳酸菌增殖。茶花蜂花粉同样富含酚类、黄酮类物质，从而对乳酸菌增殖产生负面影响。另外，β-CD-茶花蜂花粉酸羊乳中乳酸菌数量明显高于未处理组(表3)，这说明β-CD作为保护剂处理茶花蜂花粉有助于减弱其在酸乳体系中对乳酸菌生长的抑制程度。孙亚利[11]研究也发现聚合乳清蛋白-苦荞黄酮微胶囊酸乳中乳酸菌数显著高于未包埋组。从表3还可看出，酸羊乳中嗜热链球菌数量显著高于保加利亚乳杆菌，这可能与嗜热链球菌具有较强的蛋白水解活性、乳糖利用率及环境适应力有关。

持水力和质构特性是衡量酸乳品质的重要指标，可客观反映酸乳凝胶体系状态及变化。如表3所示，与对照相比，茶花蜂花粉酸羊乳持水力、硬度、稠度、内聚性及黏性指数略有下降，而β-CD-茶花蜂花粉酸羊乳持水力和质构指标则显著提高，且与β-CD-茶花蜂花粉添加量呈正相关。孙亚利[11]研究表明，苦荞黄酮经聚合乳清蛋白处理后可显著提高酸奶持水力、硬度、黏性，但内聚性和弹性与游离苦荞黄酮酸乳无明显差异。β-CD具有一个相对亲水的表面，对水分子具有较强的亲和能力[14]；马宇骥等[17]认为适量多酚与酪蛋白相互作用可提高酸奶质构，过量多酚反而会破坏原有蛋白质紧密结构。因此，茶花蜂花粉酸羊乳持水力和质构特性的变化可能与β-CD处理及体系中酚类成分改变有关。

茶花蜂花粉富含酚类、黄酮类及类胡萝卜素等多种抗氧化成分，能有效抑制或清除自由基，降低脂质过氧化反应，猝灭单线态氧，是一种优良的天然抗氧化补充剂[18]。从表3可知，茶花蜂花粉添加均使酸羊乳DPPH自由基清除率、FRAP总抗氧化能力及Fe2+螯合率显著增强，且抗氧化活性与添加量呈正相关，这应该与茶花蜂花粉水提物有效增加了酸羊乳中抗氧化成分种类及含量有关。GAGLIO等[19]同样发现藏红花中藏红花素酯、类胡萝卜素、酚类等抗氧化成分会显著提高酸奶的抗氧化活性。然而，β-CD处理对茶花蜂花粉酸羊乳的抗氧化活性影响很小(表3)。

表3 茶花蜂花粉添加对酸羊乳理化及微生物指标的影响
Table 3 Effects of C. sinensis bee pollen addition on physio-chemical and microbial indexes of goat milk yogurt

整体来看，β-CD处理茶花蜂花粉会赋予酸羊乳更佳的感官品质、持水性能和质构特性，减缓对乳酸菌增殖的抑制，同时保持较强的产酸速度及抗氧化活性，因此后面以β-CD-茶花蜂花粉酸羊乳为对象研究产品冷藏货架期内品质及抗氧化活性变化规律。

2.3 β-CD-茶花蜂花粉酸羊乳冷藏期间感官品质变化规律

β-CD-茶花蜂花粉酸羊乳冷藏期间感官品质的动态变化如增强出版附表1所示，在冷藏21 d内，β-CD-茶花蜂花粉酸羊乳色泽、风味、口感和组织形态保持良好状态，呈均匀乳黄色，气味协调，口感细腻，乳清未析出；冷藏后期(21～28 d)，部分产品出现色泽变暗、香气变差、微量乳清析出、组织状态稀薄等现象，感官得分略有下降。

2.4 β-CD-茶花蜂花粉酸羊乳冷藏期间酸度、乳酸菌数、持水力和质构特性变化规律

从图1可以看出，β-CD-茶花蜂花粉酸羊乳滴定酸度随冷藏时间延长显著增大，pH则逐渐降低，至28 d冷藏结束，YB1、YB2、YB3滴定酸度分别升高15.69%、14.56%、11.31%，pH分别降低4.31%、4.19%、2.70%；尤其在冷藏前期(0～14 d)酸度迅速增加，继续冷藏(14～28 d)，酸度升高幅度变缓。FENG等[1]研究发现红枣酸羊乳酸度0～14 d内升高较快，14～28 d上升则较为缓慢。乳酸菌在冷藏期间会进一步利用乳糖生成乳酸，尤其冷藏前期乳酸菌代谢活性较强产生大量乳酸，酸度显著升高[20]。

a-滴定酸度；b-pH
图1 β-CD-茶花蜂花粉酸羊乳冷藏期间滴定酸度和pH变化
Fig.1 Changes of titratable acidity and pH of goat milk yogurt added β-CD-C. sinensis bee pollen during refrigeration 注：不同大写字母表示同一贮藏时间酸羊乳之间 存在显著差异(P<0.05)(下同)

β-CD-茶花蜂花粉酸羊乳冷藏期间乳酸菌活菌数量变化如图2所示。在冷藏期间，对照酸羊乳活菌数持续下降，而β-CD-茶花蜂花粉酸羊乳中保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌数则呈先增加后降低趋势，贮藏7 d达到最大值，尤其YB2中2种乳酸菌活菌数分别达到了4.71×108、5.54×108 CFU/mL；继续冷藏，乳酸菌数则逐渐降低，但直至28 d冷藏结束，酸羊乳中乳酸菌数量均远大于1×106 CFU/mL，高于国家标准。KHIDER等[7]研究发现埃及蜂花粉酸乳冷藏期间乳酸菌数量呈先增加后降低趋势；而有学者[1-2]研究表明马郁兰蜂蜜酸乳、红枣酸羊乳中保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌在冷藏期间逐渐减少，造成这种差异的原因可能与蜂花粉提取物特殊的化学组成有关。此外，添加2% β-CD-茶花蜂花粉使酸羊乳贮藏期内乳酸菌数显著高于YB1和YB3(图2)，说明适量添加茶花蜂花粉更有利于维持冷藏期间乳酸菌数量。

a-保加利亚乳杆菌；b-嗜热链球菌
图2 β-CD-茶花蜂花粉酸羊乳冷藏期间保加利亚 乳杆菌和嗜热链球菌数量变化
Fig.2 Changes of the viable counts of L.bulgaricus and S.thermophilus of goat milk yogurt added β-CD-C. sinensis bee pollen during refrigeration

如图3所示，β-CD-茶花蜂花粉酸羊乳冷藏期间持水力和质构特性变化均呈先升高后降低趋势。冷藏初期(0～7 d)，持水力、硬度、稠度、内聚性和黏性指数显著上升，7 d达到最佳；冷藏中后期(14～28 d)，持水力和质构则快速下降。

a-持水力；b-硬度；c-稠度；d-内聚性；e-黏性指数
图3 β-CD-茶花蜂花粉酸羊乳冷藏期间理化指标变化
Fig.3 Changes of physio-chemical indexes of goat milk yogurt added β-CD-C. sinensis bee pollen during refrigeration

刘敏[21]研究发现红枣膳食纤维酸乳持水力同样随冷藏时间延长先升高后降低；胡锦涛等[22]发现添加红树莓、蓝莓、黑加仑浆果果渣的牛酸乳冷藏期间硬度、黏度、凝聚力和黏性指数也呈先升高后降低变化。冷藏过程中，产品酸度的进一步升高以及蛋白质等物质适当水解使酸羊乳凝胶结构增强，水分子保持能力增加；但随酸度持续累积，网状结构水解程度增大，从而降低产品持水力和质构特性[23]。此外，冷藏结束时，YB2持水力、硬度、稠度、内聚性和黏性指数最佳(图3)，表明适度添加β-CD-茶花蜂花粉(2%)同样有利于减缓酸羊乳冷藏期内持水力及质构特性变差。

2.5 β-CD-茶花蜂花粉酸羊乳冷藏期间抗氧化活性变化规律

β-CD-茶花蜂花粉酸羊乳冷藏期间抗氧化活性变化如表4所示，与对照相比，β-CD-茶花蜂花粉酸羊乳的DPPH自由基清除能力、FRAP总抗氧化能力和Fe2+螯合能力均随冷藏时间延长持续增强，且前两者增加幅度更为明显；冷藏结束时，产品品质最佳的YB2中DPPH自由基清除能力、FRAP总抗氧化能力和Fe2+螯合能力分别升高33.41%、30.91%、47.85%。

表4 β-CD-茶花蜂花粉酸羊乳冷藏期间抗氧化活性的变化
Table 4 Changes of antioxidant activities of goat milk yogurt added β-CD-Camellia sinensis bee pollen during refrigeration

注：上标不同小写字母表示同一行酸羊乳之间存在显著差异(P<0.05)；上标不同大写字母表示同一列相同指标下酸羊乳之间存在显著差异(P<0.05)

FENG等[1]研究表明红枣汁中酚类物质可促使酸羊乳DPPH自由基清除率和FRAP值在冷藏期间持续增加；GAGLIO等[19]同样发现藏红花酸奶贮藏30 d内抗氧化活性逐渐提高。乳酸菌在冷藏过程中会利用酸乳体系中的蛋白质生成多种具有抗氧化活性的氨基酸和小分子肽，而茶花蜂花粉中多酚、黄酮及类胡萝卜素等抗氧化组分在乳酸菌作用下也可能发生改变，共同促进茶花蜂花粉酸羊乳抗氧化活性的提升[24-25]。

3 结论

本文研究了茶花蜂花粉添加以及β-CD处理茶花蜂花粉对酸羊乳发酵和冷藏期间感官、酸度、乳酸菌数、持水力、质构特性以及抗氧化活性的影响。结果表明：适量添加茶花蜂花粉提高了酸羊乳感官品质，尤其茶花蜂花粉经β-CD处理后，产品色泽、风味及口感显著高于未处理组；茶花蜂花粉可有效促进乳酸菌发酵产酸，但β-CD处理会在一定程度上降低产品发酵酸度；茶花蜂花粉添加使酸羊乳中乳酸菌数有所减少，而β-CD处理则有助于减弱对乳酸菌增殖的抑制；茶花蜂花粉添加对产品持水力、硬度、稠度、内聚性和黏性指数有微弱不利影响，而β-CD处理后持水力和质构特性显著提高；无论β-CD处理与否，茶花蜂花粉酸羊乳抗氧化活性显著增强且与添加量正相关。冷藏过程中，β-CD-茶花蜂花粉酸羊乳在货架期内能够保持较好感官品质，酸度虽有所增加但均小于100 °T；乳酸菌数、持水力和质构呈先增加后降低趋势，适度添加β-CD-茶花蜂花粉有利于减缓活菌数减少以及持水能力、质构特性变差；抗氧化活性则随冷藏时间延长持续提高。茶花蜂花粉作为中国特色功能食品原料，制备成水提取物并经β-CD保护处理后添加到羊乳中开发的功能性蜂花粉酸羊乳具有优良的产品品质及抗氧化活性，有望成为受消费者和市场欢迎的新型健康酸乳产品。