果胶酶协同漆酶/谷氨酸体系改善OCC造纸强度性能的研究

废旧瓦楞箱纸板（OCC），瑞辰星生物技术（广州）有限公司；漆酶（酶活110×10⁴ U/L）、果胶酶（3×10⁴ U/g），上海麦克林生化科技有限公司；谷氨酸，上海伯奥生物科技有限公司；碳酸氢二钠，分析纯，福晨（天津）化学试剂有限公司；碳酸二氢钠，分析纯，国药集团化学有限公司。

HH-4数显恒温水浴锅（常州澳华仪器有限公司）；JB90-SH恒速电动搅拌机（上海标本模型厂）；RK3AKWT凯赛法自动抄纸器（奥地利PTI公司）；CE062抗张强度仪、CE180耐破度测定仪、248压溃测试仪、009撕裂度测试仪（瑞典L&W公司）；NanoscopeIIIa原子力显微镜（美国）；Axis Ultra DLD光电子能谱仪（英国Krates公司）；Vector 33傅里叶变换红外光谱仪（德国Thermo Fisher Scientific公司）。

利用凯赛法自动抄纸器抄造定量80 g/m²的手抄片，然后在105℃下干燥10 min。将手抄片在恒温恒湿实验室（温度（23±1）℃、相对湿度(50±2)%）放置12 h后，分别按照GB/T 12914—2008、GB/T 454—2002、TAPPI T810om-98、TAPPI T414om-12测定纸张的抗张强度、耐破度、环压强度和撕裂度。

利用凯赛法自动抄纸器抄造定量80 g/m²的手抄片，将纸样放在干净的金属板表面上，于室温下风干。剪下一小块长宽不超过1 cm的样品附着在平坦的玻璃表面上，用XPS检测纸张表面C、O元素的相对含量。测试条件：X射线源采用铝靶，工作电压125 kV，电流20 mA，真空度3.1×10⁷ Pa。样品数据从C 1s峰进行曲线拟合，线形为高斯线形。

采用AFM分析纸浆纤维表面。称取约0.5 g湿纸浆充分分散于200 mL去离子水中，用胶头滴管吸取少量纸浆悬浮液，滴在刚劈开的云母片一面上，云母片另一面用双面胶粘于导电铁片上，室温风干后使用。每种纸浆做3个样品，并确保每个样品上有几根分散且完整的纤维。使用原子力显微镜在空气中采用轻敲模式成像。扫描速度为1.0 Hz，图像分辨率为512×512像素，同时记录高度图像和相位图像，采用Nanoscope analysis 1.8软件分析图像。

将绝干浆料样品与预先干燥的KBr粉末混合在玛瑙研磨机中研磨成粉末状，在压片模具中压成全透明的薄片进行分析。扫描频率范围400～4000 cm^-1，分辨率4 cm^-1，信噪比30000∶1（峰/峰值）。

图2为漆酶、果胶酶用量对纸张抗张强度影响的响应曲面图。由图2可知，在相同果胶酶用量下，随着漆酶用量的增加，纸张抗张强度呈先增大后减小的趋势。原因是因为漆酶去除了部分木素，促进了微细纤维的暴露，增大了纤维间的结合力，从而使纸张的抗张强度增大。同时氨基酸的加入增加了纤维的羧基含量^[8]，羧基含量的增加可以提高纤维的润胀性能和柔韧性。当漆酶用量增加到12.235 U/g时，随着漆酶用量继续增加，纸张抗张强度呈现降低的趋势，因为谷氨酸在漆酶的作用下通过迈克尔加成反应将羧基嫁接在纤维上，从而增加纤维的羧基含量，因此谷氨酸含量不变时，羧基含量不变，继续增大漆酶用量对纸张强度的提升并未有明显的作用，故漆酶最佳用量为12.235 U/g。在相同漆酶用量下，随着果胶酶用量的增加，纸张强度呈先增大后减小的趋势。果胶酶可以去除部分纤维表面的抽出物和木素，使纤维内部的碳水化合物和木素暴露出来^[10]，从而可以使漆酶更好地催化氧化木素，使细小纤维更好地暴露出来，促进纤维间的结合，表现为纸张抗张强度的增加。当果胶酶用量增加到3.508 U/g时，继续增大果胶酶用量，纸张抗张强度呈现降低的趋势，过量的果胶酶加入会使纤维受到损伤，从而造成纤维强度降低，表现为纸张抗张强度降低，由此可以得出果胶酶最佳用量为3.508 U/g。

图2  漆酶、果胶酶用量对纸张抗张强度影响的响应曲面图

Fig. 2  Response surface of the effect of laccase dosage and pectinase dosage on the tensile strength of paper

图3为果胶酶预处理时间与漆酶、果胶酶用量对纸张抗张强度的响应曲面图。由图3可知，随着果胶酶预处理时间的增加，纸张抗张强度增加。当反应时间较短时，果胶酶对再生纤维的改性不充分，反应时间超过61.521 min后，再延长反应时间，预处理效果不明显，纸张抗张强度甚至表现出下降趋势，果胶酶预处理时间过长可能会损伤纤维，从而降低纸张抗张强度。

  

  

图3 果胶酶预处理时间与酶用量对纸张抗张强度影响的响应曲面图

Fig. 3 Response surface of the effect of pectinase pretreatment time and enzyme dosage on tensile strength

图4为漆酶预处理时间与漆酶、果胶酶用量对纸张抗张强度的响应曲面图。由图4可以看出，漆酶预处理时间对纸张抗张强度的影响不太明显，因为响应曲面分析选取的漆酶预处理时间是在单因素实验的基础上选取的，因此漆酶预处理时间已经处于最优值范围内，取模型预测值160 min为漆酶最佳预处理时间，由此可以得出最佳果胶酶预处理时间为61.521 min、最佳漆酶预处理时间为160 min。

  

  

图4 漆酶预处理时间与酶用量对纸张抗张强度影响的响应曲面图

Fig. 4 Response surface of the effect of laccase pretreatment time and enzyme dosage on tensile strength

通过Design Expert软件及实验数据分析得出OCC预处理的最优工艺条件为：果胶酶用量3.508 U/g、漆酶用量12.235 U/g、果胶酶预处理时间61.521 min，漆酶预处理时间160 min，结合实际操作考虑，最优组采用果胶酶用量3.5 U/g、漆酶用量12.2 U/g、果胶酶预处理时间62 min，漆酶预处理时间160 min。通过回归模型预测在此最优处理条件下抄造纸张抗张强度为2.55 kN/m；在最优条件下进行实验，抄造纸张的实际抗张强度为2.27 kN/m，由于处理条件与模型预测的处理条件不完全一致，因此最优条件下的实际纸张抗张强度值和预测抗张强度值有所偏差。

在最优条件下对OCC分别进行果胶酶和漆酶/谷氨酸协同预处理（P-Lac/Glu，果胶酶用量3.5 U/g、漆酶用量12.2 U/g、果胶酶预处理时间62 min，漆酶预处理时间160 min），单独果胶酶预处理（Pectinase，果胶酶用量3.5 U/g，不添加漆酶和谷氨酸，其他反应条件与最优组相同），单独漆酶/谷氨酸预处理（Lac/Glu，漆酶用量12.2 U/g，不添加果胶酶，其他反应条件与最优组相同），对照组（Control，不加任何试剂，其他处理条件和最优组相同）。预处理后抄造纸张与对照组纸张的性能对比如表4所示。

由表4可知，与对照组相比，预处理OCC后抄造纸张的强度均得到了不同程度的提升，尤其在最优条件下预处理抄造纸张的抗张强度、耐破度、撕裂度、环压强度较对照组分别提高24.7%、33.7%、25.5%、31.1%，效果明显好于二者单独处理，这表明果胶酶与漆酶/谷氨酸具有协同效应。

对XPS图谱中的C 1s峰进行分解，可分为4个小峰，即C1、C2、C3和C4。C1、C2、C3和C4的峰面积比即碳原子比。①C1代表只和碳、氢连接的碳原子（—C—H、—C—C），来源于纤维表面的木素和抽提物；②C2代表用σ键连有1个氧原子的碳原子（—C—O），来源于纤维素分子中的各个碳原子和木素中羟基或醚键相连的碳；③C3代表连有2个非羰基氧或1个羰基氧的碳原子（O—C—O或C=O），主要来源于木素分子中的酮基、醛基或纤维素分子的氧化产物；④C4代表连有1个羰基氧和1个非羰基氧的碳原子（O—C=O）。C1反映纤维原料中非碳水化合物的含量，即木素和抽出物的含量，C2和C3反映碳水化合物的含量，C4的含量小，在XPS中一般很难检测到。在纤维组分中，纤维素和半纤维素O原子含量多，抽出物和木素C原子含量多，因此XPS中O原子的比例高代表纤维素的比例高，而木素和抽出物的比例小，O/C比越高表示纤维表面暴露出的纤维素越多^[13-14]。

图5为不同预处理条件下纸浆纤维的C 1s分峰曲线图，而各碳价态的变化情况如表5所示。结合图5和表5可知，与未预处理的OCC浆料相比，预处理后的OCC浆料纤维表面C1含量有不同程度的降低，C2和C3含量有不同程度的增加，O/C数值有不同程度的增加，最优工艺条件下预处理OCC浆料C1相对含量降低26.23%，C2增加14.97%，C3增加11.23%，O/C增加27.88%。研究表明，碳价比可以反应纤维素、木素、抽出物的相对含量^[15]。从O/C数值的增加，C1含量的下降，C2、C3含量的增加可以得知，经预处理后的OCC浆料纤维表面木素和抽出物含量减少，碳水化合物含量增加，进一步证实了所选生物酶体系预处理对纤维表面木素和抽出物的去除作用。碳水化合物增加表示纤维表面暴露了更多的亲水性基团，纤维的吸水润胀性能增强，有利于纤维的分丝帚化和纤维间的结合，解释了预处理后OCC成纸强度提升的原因。尤其是果胶酶和漆酶/谷氨酸协同体系预处理OCC浆料后，各项指标达到最佳。

图5  不同预处理条件下纤维的C 1s 峰分峰谱图

Fig. 5  C 1s peaks of fibers under different pretreatment conditions

有研究表明，纤维的表面覆盖一层非纤维物质，即木素和抽出物，木素呈现不规则粒状结构，抽出物呈现类似球状的结构^[16]。图6为不同预处理条件下OCC浆料纤维表面的AFM图。由图6可知，未预处理OCC浆料纤维表面被颗粒状物质包裹着，基本看不见特定走向的微细纤维，而经过果胶酶、漆酶/谷氨酸、果胶酶和漆酶/谷氨酸协同预处理后的OCC浆料纤维表面颗粒状物质均减少，特别是经过果胶酶和漆酶/谷氨酸协同预处理后的OCC浆料纤维表面微细纤维走向明显。说明经过酶预处理可以使微细纤维更好地暴露出来，有利于纤维的分丝帚化，有利于增加纤维间的结合能力，从而提高纤维成纸强度，这一结果与XPS结果一致。

图6  不同预处理条件下纤维表面的AFM图

Fig. 6  AFM images of fiber surface under different pretreatment conditions

红外光谱分析采用基线法，1429 cm^-1处左右为木素苯环骨架的伸缩振动吸收峰和碳水化合物—CH₂变形振动吸收峰，其峰相对比较稳定，分析以此峰作为基准数值表示其他峰的强度。图7为不同预处理条件下OCC浆的FT-IR图。表6为不同预处理条件下OCC浆纤维吸收峰的相对吸收强度。3349～3406 cm^-1处为分子间氢键—OH拉伸的吸收峰，从图7和表6可以看出，与对照组相比，不同酶预处理后的OCC浆特征峰相对强度有不同程度的增加。这可能是由于不同酶预处理OCC浆纤维后，纤维中的木素逐渐降解，进而产生更多的羟基，增强了纤维间的结合力，也可以解释预处理后的OCC浆料有更好的物理性质。1373～1375 cm^-1处是木素芳羟基O—H变形振动和纤维素/半纤维素聚糖或脂肪族C—H弯曲振动，经过不同酶预处理后，纸浆在该处的吸收峰强度均增加，表明酶预处理会部分去除纸浆中含有的木素，提高碳水化合物的相对含量，和上述结论一致，果胶酶和漆酶/谷氨酸协同预处理的效果最好。

图7  不同预处理条件下OCC浆的FT-IR谱图

Fig. 7  FT-IR spectra of OCC pulp under different pretreatment conditions