水质生物毒性测量中藻类光合荧光参数与初始生物量的关系

蛋白核小球藻（C.pyrenoidosa， FACHB-5）为中国淡水水域的一种常见绿藻，具有分散均匀、不易粘壁的特性。因此本研究以蛋白核小球藻为受试藻种，采购于中国科学院水生生物研究所淡水藻种库。该藻种培养在恒温摇床（MQD-S3R）中进行，光源为白色冷荧光灯管，培养条件为：温度25±1 ℃、转速120 r·min^-1、光照强度120 μmol·m^-2·s^-1、光暗比12 h∶12 h。待藻液培养2~3天，达到对数生长期，以其开展实验研究。

采用藻类分析仪（ FluoroProbe，德国BBE公司）对培养至对数生长期的蛋白核小球藻进行叶绿素浓度（生物量）测量，并根据实验需要以灭菌后的BGII培养基对藻液进行稀释，获取一系列不同生物量的藻液，以开展不同生物量蛋白核小球藻对敌草隆（3-（3，4-dichlorophenyl）-1，1-dimethylurea，DCMU）响应研究。由于胁迫物质敌草隆（DCMU，阿拉丁（中国上海），纯度99%）在水中溶解度很低，因此使用二甲基亚砜（DMSO，阿拉丁（中国上海），纯度>99%）作为溶剂配制DCMU胁迫下蛋白核小球藻的待测样品，最终单个样品体积为50 mL，DCMU的浓度分别为0、1、2、5、10、20、40 μg·L^-1（样品中DMSO含量小于0.1%），所有样品以同样方式制得3份。

采用ACT2&FastOcean FRR藻类荧光系统（英国CTG公司）对DCMU胁迫下不同蛋白核小球藻的待测样品进行光合荧光参数测量，以分析DCMU对不同初始生物量蛋白核小球藻光合荧光参数的影响。该系统由FastOcean快速重复率荧光仪和ACT2实验室系统组成。测量过程中，激发光源选择450 nm的LED，光化光设置从0到800 μmol·m^-2·s^-1共8个光强值，获取待测样品的快速光曲线（Fast Light Curve，FLC），并得到如表1所示的11个光合荧光参数，单个样品测量周期约为3 min。

图1（a）和图1（b）为10 μg·L^-1 DCMU短期胁迫下（1 h和3 h），不同初始生物量样品对应光合荧光参数的毒性响应情况，以处理组与空白组的比值（球型）表示。其中灰色实线（100%）表示空白组，球型分布于实线上方，表明该参数受到促进作用；球型分布于实线下方，表明该参数受到抑制作用。柱形指示的是不同光合荧光参数在初始生物量变化情况下获得毒性测试数据的相对标准偏差（Relative Standard Deviation，RSD）。

图1  短期胁迫下，不同初始叶绿素浓度对应的11个光合荧光参数对10 μg·L^-1 DCMU的毒性响应情况

Fig. 1  Under short-term stress， the toxic response of 11 photosynthetic fluorescence parameters corresponding to different initial chlorophyll concentrations to 10 ug·L^-1 DCMU

由图1可知，参数F_v/F_m、Yield、α、rP、σ_PSⅡ以及τ_es的毒性测试结果基本不随蛋白核小球藻初始生物量的变化而变化，当叶绿素浓度在20~1 000 μg·L^-1的区间内变化时，10 μg·L^-1 DCMU胁迫1 h与3 h时该六个参数测试结果对应相对标准偏差RSD均低于5%，对应平均值分别为2.74%与3.12%；而参数Ek、F₀、F_m、F_v和JVPⅡ，其测试结果则明显受到初始生物量的影响，当叶绿素浓度在20~1 000 μg·L^-1区间内变化时，DCMU胁迫1 h与3 h时五个参数测试结果对应相对标准偏差RSD均高于10%，对应平均值分别为14.66%与17.27%。以上结果表明，当叶绿素浓度在20~1 000 μg·L^-1的区间内变化时，短期胁迫下，光合荧光参数F_v/F_m、Yield、α、rP、σ_PSⅡ以及τ_es对DCMU的毒性测试结果更为稳定，不受测试样品初始生物量的影响。

为充分了解光合荧光参数与生物量（叶绿素浓度）的关系，分析参数与生物量的相关性是否对毒性响应稳定性造成影响，进一步测试了当蛋白核小球藻叶绿素浓度在20~1 000 μg·L^-1的区间内变化时，未受胁迫状态下蛋白核小球藻11个光合荧光参数数值随叶绿素浓度变化的规律，并分别计算了同一光合荧光参数在不同藻生物量下的相对标准偏差RSD，结果如图2。

图2  11个光合荧光参数数值随叶绿素浓度的变化趋势

Fig.2  The trend of 11 photosynthetic fluorescence parameters with chlorophyll concentration

由图2可知，11个光合荧光参数可分为两类，第一类为F_v/F_m、Yield、α、rP、σ_PSⅡ和τ_es，其数值基本不随叶绿素浓度的变化而变化，当叶绿素浓度在20~1 000 μg·L^-1范围变动时，F_v/F_m、Yield、α、rP、σ_PSⅡ和τ_es测得数值的相对标准偏差RSD分别为3.00%，3.66%，3.80%，3.67%，0.09%和7.74%，具有很好的一致性，说明这类参数只表征蛋白核小球藻的光合信息，与藻类生物量变化不相关。第二类参数为Ek、F₀、F_m、F_v以及JVPⅡ，这些参数随叶绿素浓度变化表现出一定的变化趋势，其数值受生物量影响，其中Ek与叶绿素浓度呈负相关，F₀、F_m、F_v以及JVPⅡ与叶绿素浓度呈现正相关，说明这些参数的数值变化除了包含光合系统信息，也反映了一定的生物量信息。结合2.1节所得结论，可知当初始生物量发生变化时，光合荧光参数与生物量的相关性会影响毒性测试结果的稳定，与生物量无关的第一类参数获取的毒性测试结果更稳定。

稳定敏感的毒性剂量效应分析是水质生物毒性测量的关键。由于涉及参数众多，为筛选出能与毒物建立良好剂量效应的参数，并针对该参数提出最佳的初始生物量区间，本研究以处理组与空白组的比值作为纵坐标，DCMU的浓度为横坐标，利用Logistic函数建立了不同初始生物量对应光合荧光参数的剂量效应曲线，得到了对应曲线的相关系数R²以及毒性数据EC₂₀（产生20%效应对应的毒物浓度）、EC₅₀（产生50%效应对应的毒物浓度），如表2。并以参数F_v/F_m、F_m为例，展示了DCMU胁迫下，参数F_v/F_m、F_m及对应的毒性数据EC₂₀随测试样品初始生物量的变化趋势，如图3。

图3  参数数值及对应DCMU毒性数据EC₂₀随初始叶绿素浓度的变化趋势

Fig. 3  The value of the parameter and the corresponding DCMU toxicity data EC₂₀ change trend with the initial chlorophyll concentration

由表2可知，在DCMU胁迫下，第一类参数F_v/F_m、Yield、α、rP、σ_PSⅡ、τ_es均呈现出良好的剂量效应关系（R²>0.9），第二类参数中只有F₀、F_m以及F_v呈现出良好的剂量效应关系（R²>0.9）。以EC₅₀、 EC₂₀以及R²作为主要的分析参考依据（R²>0.9，EC₅₀和EC₂₀数值较低），给出了当以参数F_v/F_m、Yield、α、rP、σ_PSⅡ、τ_es、F₀、F_m以及F_v作为DCMU毒性测试终点时测试样品初始生物量的最佳范围。对第一类参数F_v/F_m、Yield、α、rP、σ_PSⅡ、τ_es，最佳的藻类初始叶绿素浓度（生物量）范围为10~2 000 μg·L^-1，在此范围内所获取的毒性数据EC₂₀、EC₅₀数值低且稳定，符合2.1节所述结论，但是当初始叶绿素浓度为4 μg·L^-1时，EC₅₀与EC₂₀明显偏高，分析原因是由于藻种具有群体依赖性^［15］，过低的生物量会影响藻种的光合生理状态，本研究中也确实发现当叶绿素浓度降到4 μg·L^-1，藻光合活性F_v/F_m发生了突降（图3（a））。对第二类参数F₀、F_m与F_v，最佳的藻类初始叶绿素浓度（生物量）范围为200~1 000 μg·L^-1，在此范围内所获取的毒性数据EC₂₀、EC₅₀数值低且稳定。此外，当初始叶绿素浓度为2 000 μg·L^-1，剂量效应曲线的拟合效果较差；当初始叶绿素浓度在4~100 μg·L^-1范围内时，叶绿素浓度越低，EC₅₀与EC₂₀越高。