高分子免疫佐剂材料

佐剂是一种添加到疫苗中，使疫苗能够非特异性地增强机体对抗原的特异性免疫应答的物质，具有诱发机体产生高效、持久、深远的特异性免疫反应[1]，减少抗原用量和疫苗接种剂量[2]，提高疫苗稳定性和机体免疫耐受性[3]等特点. 早期疫苗，如天花疫苗和牛痘疫苗，以活病毒中提取的病毒核酸及病毒外壳作为佐剂. 直到Pope和Glenny发现破伤风类毒素能够被不溶性铝盐吸附，这才使得铝佐剂(尤其是磷酸铝或氢氧化铝)成为疫苗中最常用的佐剂之一[4]. 目前，随着亚单位疫苗的发展，佐剂的作用显得尤为重要. 狭义上来讲，佐剂是指一些分子佐剂，如模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)激动剂等；但广义上来讲，能够增强免疫响应的材料都可以被称为免疫佐剂材料. 因此，佐剂材料的发展越发成为疫苗及免疫治疗领域的重要前沿和热点问题.

依托于高分子材料而开发的新型生物医学治疗手段正在受到越来越多的关注. 由于其高分子量[5]、丰富的结构可调性[6]以及功能性特点，高分子材料经过组装形成的纳米或微米结构在担载药物分子[7]、靶向递送到生物组织和细胞[8]等方面表现优异，已经成为疾病治疗和机体系统调控的重要工具. 利用高分子材料来调节固有或获得性免疫响应具有很长的先例. 早在1930年，Goebel和Avery就报道过将碳水化合物键合到蛋白上形成的糖蛋白能够调控肺炎球菌疫苗的免疫响应[9,10]；1965年，Scherr等发现亲水聚合物藻酸盐微/纳米颗粒佐剂可以显著提高抗体滴度[11]，次年，Benet等也报道了聚乙二醇佐剂对4种巴比妥类药物肠道吸收的影响[12]. 随着研究人员对高分子结构设计了解的深入，具有固有免疫刺激能力的高分子逐渐被应用到生物医学领域中[13]，如组织工程支架、药物递送、药物辅料、抗菌涂层、基因递送载体等. 越来越多的证据证明，一些高分子具有固有免疫刺激能力，能够诱导免疫响应或免疫毒副作用. 这一特征是高分子材料用于生物医学时需要被关注的部分，也可以被利用来对机体进行主动的靶向或调控. 实际上，很多天然高分子，如细菌糖肽和单链DNA，由于其具有区别于机体“自我”的，能够被免疫系统识别为“非我”或“有害分子”的结构特性，正适合作为生物体内的天然免疫原[14,15]. 这类天然的或合成的具有免疫活性的高分子佐剂与小分子佐剂相比，能够更好地进入细胞，具有更高的与免疫受体结合的能力，并具有更佳的药代动力学特征，能够在降低成本的同时实现参数可调的免疫响应佐剂新途径.

在本专论中，我们提出了高分子免疫佐剂材料这一概念，并讨论了当前以高分子材料为基础的免疫佐剂材料所取得的进展，进行了代表性应用举例. 一方面，将介绍本身具有免疫佐剂功能的高分子材料，包括天然高分子免疫佐剂材料和人工合成的高分子免疫佐剂材料；另一方面，将介绍与抗原或佐剂结合的高分子材料，以及其在抗原及小分子佐剂的体内传输中所起到的作用. 我们将举例讨论这些材料如何在疫苗及肿瘤免疫治疗中发挥重要作用.

1 免疫应答与佐剂

免疫系统在机体防御外源病原体入侵及调控自体平衡方面扮演着关键角色. 据统计，人体一半以上的疾病都与免疫系统相关，因此，疫苗是人体抵御疾病的重要工具. 接种疫苗的目的是调动机体的免疫系统，使其对外来抗原产生强烈而持久的免疫反应. 哺乳动物先天免疫系统的关键功能包括快速识别病原体和/或组织损伤以及向适应性免疫系统的细胞发出危险信号[16]. 该过程包括抗原提呈细胞(antigen presenting cells，APCs)如树突细胞和巨噬细胞捕获侵入机体的病原体，将其吞噬后分解为较短的肽链段，并装载到主要组织相容性复合体Ⅰ或Ⅱ (MHC-Ⅰ，MHC-Ⅱ)上，将信号呈递给未成熟的T细胞，从而启动免疫反应[8,17]. 在此过程中，如果缺乏免疫刺激分子，免疫响应就无法被抗原呈递过程激活，进而导致T细胞的无效能或耗竭. 而当机体内存在免疫刺激分子时，APCs则能够被病原相关分子模式(PAMPs)或损伤相关分子模式(DAMPs)经APCs表面、内涵体或细胞质中的模式识别受体激活，并分泌炎性因子，进而活化接受抗原呈递的T细胞，使其快速做出免疫响应.

获得性免疫响应也被称为特异性免疫响应，由T细胞受体(TCRs)和B细胞受体(BCRs)产生，并且仅攻击曾遇到过的抗原[18]. TCRs在CD8和CD4分子的协助下，分别结合APCs表面被MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ分子呈递的抗原，并产生CD8+细胞毒性T细胞(CTL)来杀伤肿瘤细胞或清除被病原体感染的细胞；或者产生CD4+辅助T细胞分泌炎性因子来增强CD8+T细胞或B细胞的免疫响应. BCRs则主要识别抗原大分子如蛋白或多糖，刺激未成熟的B细胞与抗原结合并在CD4+辅助T细胞分泌的细胞因子的作用下分化成浆细胞，分泌大量的抗体并吸附在病原体表面，使病原体更容易被吞噬细胞吞噬. 不同的细胞因子会使B细胞的抗原表型发生改变，如从分泌IgM和IgD型抗体转变为分泌IgG2或IgA型抗体[19] (图1).

Fig. 1  Schematic overview of the adaptive immune response processes. Antigens are processed by antigen presenting cells (APCs) and presented to CD8+ and CD4+ T cells to initiate cellular immune responses through the interaction of major histocompatibility complexes (MHC-I and MHC-II) and T cell receptors (TCRs); during which process, APCs are activated and secrete inflammatory cytokines through the recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) or damage-associated molecular patterns (DAMPs) by pattern recognition receptors (PRRs). B cells could also recognize antigens with the help of CD4+ T cells and translate into plasma cells to secrete antibodies for humoral immune responses.

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固有免疫响应又称先天免疫响应或非特异性免疫响应，通过模式识别受体识别病原体. 因此在给予抗原的同时给予能够结合PRRs的免疫刺激剂对于疫苗和免疫治疗的实施至关重要. 这些与抗原同时使用的，用于调控免疫响应的分子激动剂就是佐剂. 以往的预防性疫苗主要采用减毒或灭活的病原体，其本身具有PAMPs刺激成分，能够起到类似佐剂的免疫调控作用[1]；而近年来发展的亚单位抗原，如多肽抗原和mRNA抗原由于单独的抗原不足以产生高免疫原性，因此必须添加佐剂来增强其免疫原性[20]. 目前设计合成分子佐剂以引发特异性的细胞因子释放进而用于疫苗和肿瘤免疫治疗已经成为研究焦点. 然而，分子佐剂经常会造成过度的细胞因子分泌并引起发烧、注射部位疼痛或其他副作用症状，甚至可能引发炎性因子风暴等致命副作用[21]. 因此，将抗原和佐剂共装载在同一个递送载体(如辅助乳液[22]和脂质体佐剂[23])中，实现对于特定的免疫细胞亚型的靶向性，或者在保持疫苗性能的同时降低佐剂给予剂量，对于疫苗的成功是十分必要的. 尽管如此，目前除了铝佐剂外，只有MF59 (含角鲨烯的水包油乳剂)、AS03 (含角鲨烯、维生素E和Tween80)、含单磷酰基脂质A (monophos-phoryl lipid A, MPL)的AS01和AS02佐剂，以及胞嘧啶鸟嘌呤寡聚脱氧核苷酸(CpG oligo- nucleotide，CpG-ODN)等少数几种佐剂被FDA批准应用于人类疫苗. 分子佐剂的临床试验中造成的脱靶问题成为限制此类佐剂在疫苗中应用的关键.

高分子免疫佐剂材料经过严格的早期生物相容性测试，为解决小分子免疫佐剂材料的副作用问题提供了新的思路. 特别是，高分子免疫佐剂材料能够自组装形成纳米结构，具有与病原体类似的尺寸、形状、分布等，本身容易被抗原提呈细胞等识别；其次，高分子免疫佐剂材料能够通过物理包埋或化学键合的形式担载分子佐剂，经过多种分子设计而实现器官选择性靶向，并可控递送其所担载的免疫成分，降低系统暴露[24]，从而能够为设计新的疫苗和肿瘤免疫治疗范式带来解决思路. 在接下来的部分中，我们将介绍相关方面的一些代表性工作.

2 具有固有免疫刺激活性的天然高分子材料

固有免疫系统能够识别具有病原体特性的病原相关分子模式，例如细菌脂多糖、未甲基化的CpG DNA，鞭毛蛋白等[25]. 这一类具有免疫佐剂活性的天然高分子能够从生物质中直接提取而来，并在作为疫苗佐剂用于免疫治疗时，发挥促进抗原呈递、形成抗原储库、调节免疫响应类型等作用[26]. 例如作为生命体重要组成之一的糖分子既是细胞膜主要结构成分之一，同时又在很多生理识别中扮演重要作用. 目前，多种聚多糖已被证实具有刺激免疫响应的作用，其往往通过与C-型凝集素的结合而发挥作用. C-型凝集素的定义起初是被用来区分Ca 2+依赖性和Ca 2+非依赖性碳水化合物结合凝集素的[27]，这些C-型凝集素包括结合甘露聚糖的DC-SIGN、结合β-葡聚糖的Dectin-1、结合唾液酸的唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素(Siglecs)等. 结合C-型凝集素的碳水化合物佐剂与传统的分子佐剂相比往往具有更低的毒性. 此外，天然来源提取的糖脂分子、皂苷、α-半乳糖基神经酰胺等也能够经Toll样受体4 (TLR4)、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3 (NLRP3)和CD1d等激活免疫反应. 例如皂苷是一种两亲性的含有萜类分子的寡糖，自1970年以后开始被投入使用，能够经多种PRRs增强抗原内吞、平衡Th1和Th2响应等[28]；皂苷提取物已经被用于多种佐剂剂型中并获得批准(如AS01，Matrix-M等)，用于带状疱疹、疟疾与新冠病毒等的疫苗当中[29].

2.1 甘露聚糖(mannan)

甘露聚糖是一种酵母多糖，具有可被巨噬细胞、B细胞和DC上的模式识别受体识别的重复碳水化合物单元[30]，是细胞介导免疫的有效抑制剂. 已有研究人员提出甘露聚糖或甘露聚糖分解代谢物能够作用于单核细胞或抑制性T淋巴细胞[31]. 甘露糖受体CD206主要存在于巨噬细胞和树突状细胞的表面，它是一种I型膜受体，可以结合真菌和其他病原体上发现的末端甘露糖，并介导巨噬细胞对糖蛋白的内吞，已被证明可介导对真菌抗原的体外细胞免疫反应[32,33]. 这一特点使得甘露聚糖能够经受体或浆细胞DC (pDC)的主动转运作用而增加疫苗向淋巴结的聚集. 此外，甘露聚糖自身还具有激活TLR4的作用. 利用甘露聚糖的这些特性，以甘露聚糖为壳，聚乳酸-聚乙烯亚胺(PLA-PEI)为核组装制备纳米颗粒疫苗，蛋白抗原和Toll样受体9 (TLR9)激动剂CpG通过静电相互作用吸附在PLA-PEI内核上. 我们发现，甘露聚糖修饰可以大大增强纳米颗粒疫苗的淋巴结引流能力，并且甘露聚糖本身作为TLR4激动剂可以与 CpG 协同最大程度地激活 DC，从而诱导强有力的抗肿瘤免疫反应[34].

2.2 β-葡聚糖

β-葡聚糖是真菌细胞壁中发现的β1→3和β1→6连接的聚多糖，其能够被CD3、Dectin-1和TLR2等多种免疫受体识别. C型凝集素Dectin-1是一种β-葡聚糖受体，存在于巨噬细胞上，可以识别各种β-葡聚糖[35,36]. 由于β-葡聚糖的易获得性、低毒性，以及可以形成纳米颗粒等特性，以β-葡聚糖为原料制备的疫苗制剂具有很多优于传统佐剂的特点. Seong等发现，用β-葡聚糖刺激巨噬细胞会增加肿瘤坏死因子-α (TNF-α)的表达. 当用β-葡聚糖和脂多糖(LPS)共同刺激细胞时，可以通过增加的TNF-α表达观察到协同效应. 在白细胞介素-6 (IL-6)表达中，任何β-葡聚糖本身不能诱导IL-6表达. 然而，当β-葡聚糖和LPS发生共刺激时，细胞通过增加IL-6表达显示出强烈的协同作用. 这说明了β-葡聚糖能够增加免疫调节基因的表达，并显示出与LPS的协同作用[36]. 目前，将β-葡聚糖应用于临床的主要障碍是合成和分离具有精准明确结构的β-葡聚糖，这仍是高分子化学家需要解决的问题.

2.3 壳聚糖

壳聚糖是一种从甲壳素中提取的多糖，其作为可溶性蛋白质的输送系统具有相当大的潜力. 它是一种由具有正电荷的，β1→4葡萄糖胺连接的天然高分子材料，具有良好的生物相容性. 壳聚糖的局部鼻内、皮下、眼部或局部给药通常是安全的，副反应症状轻微[37]. 此外，壳聚糖能够通过一系列固有免疫识别受体促进DC成熟并分泌I型干扰素. 2011年，Heffernan等的研究使用了黏性壳聚糖溶液和IL-12 (一种 Th1 诱导细胞因子)开发了一种疫苗佐剂系统. 皮下注射后发现，壳聚糖/IL-12/OVA 疫苗能显著提高CD4+脾细胞增殖、Th1细胞因子释放、CD8+ T 细胞干扰素-γ(IFN-γ)释放和MHC I类肽的量，从而引发更强烈的抗原特异性 CD4+和 CD8+T 细胞反应. 壳聚糖和 IL-12 的组合还能增强IgG2a 和 IgG2b抗体对OVA 的反应，进而促进模型蛋白疫苗诱导的 Th1 免疫反应的产生[38]. 壳聚糖诱导Th1免疫反应的机制是壳聚糖能够增加线粒体压力和活性氧的产生，导致线粒体DNA向细胞质中的泄露，最终活化胞质中的cGAS-STING通路生成I型干扰素(IFN-I)[39]. 除了STING通路，壳聚糖还被报道能够活化NLRP3炎性小体通路，与TLR2、TLR4和巨噬细胞甘露糖受体(MMR)等多种PRRs结合，并形成抗原储库来发挥佐剂功能[40]. 除此之外，多项研究还证实壳聚糖能够增强黏膜免疫，从而可以用于吸入疫苗的设计，这得益于壳聚糖所带的正电荷能够帮助它更高效地穿过黏膜而递送抗原和刺激固有免疫响应[41]. 与其他多糖一样，壳聚糖复杂的多价结构导致机制研究的困难，对于壳聚糖在疫苗佐剂中的转化问题仍需要进一步研究.

3 具有固有免疫刺激活性的合成高分子材料

合成高分子材料作为药物传输材料通常不具有免疫活性，但近年来的一些研究则发现一些合成高分子材料本身就能够作为危险信号而激起免疫响应[42]. 随着PRR识别机制在分子层面被更好地理解，合理设计合成的高分子材料可以可控地打破细胞器稳态、与天然受体相互作用、并引发固有免疫刺激活性. 这类具有PRR功能的合成高分子材料相比传统的PRR小分子激动剂具有低成本、高可调性和与现有疫苗或免疫治疗体系的兼容性更好[6~8]等优势，彰显了良好的转化前景. 当前报道较清楚的两类能够被合成高分子作为危险信号激活的PRR通路是STING和NLRP3受体，这可能是由于这两个通路与其他的模式识别受体不同，它们位于细胞质当中，并且具有更广泛的识别能力(而其他模式识别受体的专属性更强).

3.1 活化STING通路的合成高分子

干扰素基因刺激因子(stimulator of interferon genes，STING)是一类位于内质网上，对固有免疫具有强烈激活作用的适配蛋白，它在识别细胞质中的双链DNA (dsDNA)后被激活，在一系列过程作用下引发I型干扰素的分泌[43]. STING通路的活化通常包括两个步骤，一是环状GMP-AMP合成酶(cGAS)与胞质中的dsDNA结合后催化三磷酸腺苷(ATP)和三磷酸鸟苷(GTP)合成“第二信使”——环二核苷酸(2'3'-cGAMP)或其他环二核苷酸，如环状-di-AMP(c-di-AMP)或c-di-GMP[44,45]，之后这些环二核苷酸(统称为CDNs)与内质网上的STING蛋白域结合，使STING蛋白构象发生改变，并从内质网迁移到高尔基体，聚集形成STING蛋白多价聚集体，最终招募下游TBK1和IRF3，并使其发生磷酸化，驱动IFN-I相关的干扰素刺激基因(ISGs)的转录[46,47] (图2(a)). 利用STING激动剂来发展肿瘤疫苗的优势在于STING通路主要刺激干扰素产生从而引发Th1型CTL响应，而较少产生容易带来炎性副作用的炎性因子，可以在高效激活免疫的同时减低炎性副作用.

Fig. 2  The cGAS-STING pathway and related polymeric stimulants. (a) Mechanism of cGAS-STING pathway; (b) Screening of azole molecules tethered branched polyethylenimine (PEI-M) as polymeric STING agonists (Reprinted with permission from Ref.‍[51]; Copyright (2022) Wiley‐VCH GmbH).

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尽管小分子仍是STING激动剂研发的主要类型，近年来的一些研究发现一些合成高分子材料也具有STING激活功能. Shae及其课题组的同事为了解决小分子环二核苷酸细胞靶向性差、清除速度快和向 STING 定位的细胞质的转运效率低等问题，设计了具有pH响应、膜去稳定活性的聚(乙二醇)-嵌段-((2-(二乙基氨基)甲基丙烯酸乙酯)-co-(甲基丙烯酸丁酯)-co-(吡啶基二硫化物甲基丙烯酸乙酯))聚合物纳米囊泡，用于激活STING通路. 该聚合物纳米囊泡能够增强肿瘤微环境和前哨淋巴结中的 STING 信号传导，使得cGAMP 被有效地封装到囊泡当中，而在进入溶酶体后则会在酸性条件下而分解解体，从而实现增强的 STING通路内源性环二核苷酸配体的胞质递送[48]. 此外，美国西南医学中心的高金明课题组也报道了一种聚乙二醇嵌段聚甲基丙烯酸甲酯键合七元环胺(PC7A)的结构，其被发现能够与STING蛋白直接结合而引发STING蛋白的聚集以及下游TBK-1活化和I型干扰素的产生. 该研究证明，PC7A作为疫苗载体表现出比传统小分子佐剂更好的治疗效果. 重要的是，由于STING激活主要产生的是I型干扰素而较少产生IL-6等炎性因子，采用STING激动剂作为疫苗佐剂能够带来的副作用更小. 此外，由于PC7A与STING的结合位点与内源环二核苷酸并不相同，PC7A能够与2',3'-cGAMP联合作为双STING激动剂治疗，在多种肿瘤模型上表现出出色的肿瘤治疗效果[49,50]. 我们的研究团队则筛选了一系列五元含氮杂环小分子及其苯并结构，将其键接到支化聚乙烯亚胺上，发现这一结构体系(PEI-M)也可以刺激细胞内STING通路的活化及I型干扰素的分泌；而小分子和支化聚乙烯亚胺本身并不具备这样的刺激活性[51](图2(b)). 这一结果证实，含氮杂环结构小分子修饰的高分子材料可能是一类潜在的STING激动剂材料. STING作为一种位于细胞质中的内源性受体，除了识别天然cGAMP小分子而激活外，还能够被人工合成的聚合物材料所激活，这一发现非常有趣，也为开发基于合成高分子材料的免疫佐剂带来了新思路.

3.2 活化NLRP3的合成高分子

NLRP3是一种细胞内传感器，主要分布于间质及细胞膜中，参与多种宿主免疫和炎症反应. 与其他PRR不同，NLRP3在包括线粒体上积累的活性氧[52]、机体内结晶物质如单钠尿酸盐(MSU)晶体、二水焦磷酸钙(CPPD)晶体、胆固醇晶体[53,54]，以及ATP[55]等多种刺激下都会发生构象的转变和活化. NLRP3被激活后，会发生蛋白质结构的转变，暴露嘧啶核苷(PYD)，并结合凋亡相关ASC和pro-caspase-1，形成NLRP3炎性小体，剪切产生有活性的Caspase-1，促进IL-1β和IL-18的分泌以及细胞焦亡的发生[56] (图3). NLRP3炎性小体在多种疾病中都扮演重要角色，如痛风[53]、动脉粥样硬化[55]、肥胖和阿尔兹海默症[57]等，也被认为是疫苗和免疫治疗的重要靶点.

Fig. 3  The NLRP3 inflammasome pathway.

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利用合成高分子来活化NLRP3炎性小体作为佐剂并用于生物治疗是很吸引人的，可以解决小分子激动剂的来源困难、免疫毒副作用等问题. 近年来发现阳离子聚合物能够通过内涵体、溶酶体的破坏而活化NLRP3炎性小体. Turley等报道了一种脱乙酰化的壳聚糖，它是一种阳离子多糖，具有生物相容性和可生物降解的性质[58]. 该研究证明，脱乙酰化的壳聚糖能够诱导NLRP3炎性小体活化并分泌IL-6、IL-1β等细胞因子. 离子聚合物被细胞吞噬后能够插入内涵体的膜表面，在内涵体酸化过程中导致膜的破裂，并通过质子海绵效应和内涵体逃逸实现NLRP3炎性小体的活化. 通过调节聚合物的性质来调控内涵体的裂解程度是精准控制NLRP3炎性小体活化的有效手段. 例如：Esser-Kahn的研究组发现树枝状骨架包含不同比例的阳离子氨基酸和四(乙烯乙二醇)结构域能够调节内涵体和溶酶体的间充质压力，从而控制下游Caspase1和IL-1β的活性[59] (图4(a))；Baljon等报道pH响应聚合物中丁基甲基丙烯酸酯与2-二甲氨基乙基乙酸酯的比例能够调节内涵体破裂和炎性小体活化的程度[60]；Nandi等报道聚乙二醇嵌段香豆素甲基丙烯酸甲酯和辛基丙烯酸甲酯中的烷基链的含量同样会影响内涵体破裂的速率以及炎性小体的活化情况[61] (图4(b)). 上述结果证实聚合物结构中的微小改变即会对其活化NLRP3炎性小体的活性产生影响，这也为筛选具有不同需求的高分子佐剂材料提供了可能.

Fig. 4  Precisely control the activation of the NLRP3 inflammasome by regulating the properties of the polymers. (a) Structure of dendritic lysines capped by histidine and tryptophan and cofunctionalized by TEG chains (efficiently/inefficiently ruptures lysosomes) (red, histidine; blue, tryptophan) and proposed mode of action (Reprinted with permission from Ref.‍[59]; Copyright (2018) American Chemical Society); (b) Polymer structure of a core hydrophobicity nanoparticle-associated-molecular pattern (NAMP) responsible for activating NLRP3 inflammasome (Adapted from permission from Ref.‍[61]; Copyright (2021) American Chemical Society).

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4 键合或担载抗原的高分子佐剂材料

高分子材料作为载体材料担载药物用于药物的靶向传输、可控持续释放等，在过去得到了大量的研究，已有多种多样的敏感键合方法、组装结构，以及智能响应设计被报道出来[62~65]. 在免疫治疗当中，利用高分子材料进行化学键合，或者物理担载免疫原性成分可以充分发挥高分子的多价效应、递送功能和缓释功能等，从而实现一种或多种免疫成分的增效协同并降低免疫成分的免疫相关副作用，并使得高分子材料成为新型的更有潜力的免疫制剂类型. 在本部分中，我们将介绍化学键合及物理担载免疫激动剂药物的例子.

4.1 高分子材料共价键合免疫佐剂提升免疫佐剂活性

利用高分子材料共价键合免疫佐剂为设计具有精准化学结构和分子组成的高分子免疫佐剂提供了一种有吸引力的方法. 高分子材料可以被设计为线性的、树枝状的或超支化的大分子，用于满足不同情况下的载体需求. 例如：为了使疫苗实现对于多种抗体(体液免疫)和CD8+T细胞反应(细胞免疫)的激发，Hubbell的研究组设计了一种高分子药物偶联物——p(Man-TLR7) 的合成糖佐剂，这种高分子佐剂能利用靶向甘露糖结合C型凝集素的优势来有效地协同传递抗原和聚合佐剂，从而增强疫苗的免疫效率[66]. 首先，他们将含有TLR7激动剂的甲基丙烯酰胺单体和含有甘露糖的甲基丙烯酰胺单体进行可逆加成-断裂链转移聚合(RAFT)，制备得到了免疫活性聚合物p(Man-s-TLR7)，再经自断裂连接键与模型抗原OVA蛋白偶联得到疫苗. 该疫苗在体外实验中展现出良好的内吞能力和将抗原呈递给T细胞的能力，并且能很好地靶向DC细胞或通过TLR7激活DC. 在经过糖基化处理后，该疫苗与缺乏甘露糖靶向或TLR7配体的聚合物偶联的OVA相比，激发了更显著的体液和细胞免疫. 在利用模型抗原OVA证实这一特征后，作者将疟疾的环子孢子蛋白抗原CSP与p(Man-TLR7)缀合，并与由 CSP和脂质体组成的制剂进行比较，结果表明，只有CSP-p(Man-TLR7)疫苗组产生了CSP特异性CD8+ T细胞免疫反应，表现为TNFα+、IFN-γ+、CD8+ T细胞的百分比的显著增加，同样证实了这一键合设计在增强抗原特异性T细胞和B细胞免疫方面的作用.

Lynn和Laga等将小分子TLR7/8激动剂R848通过噻唑啉-2-硫酮键合到聚N-(2-羟基丙基)甲基丙烯酰胺骨架上，得到温度响应聚合物-键合TLR-7/8a，并将其作为疫苗佐剂用于灵长类动物实验中[67]. 作者详细研究了免疫激动剂的接枝密度、电荷、纳米组装形式等对于该材料的免疫活性的影响，证实大分子免疫佐剂材料的物理化学性质对于材料免疫原性影响的重要性. 除了线性聚合物，树枝状大分子也可以用来键合抗原和佐剂，特别是树枝状大分子的结构能够增加溶解性并将佐剂暴露在表面. 例如：Wang及合作者们最近报道了一种负载有光敏剂二氢卟酚e6 (Ce6)的缺氧响应性两亲聚赖氨酸树枝状大分子(HAD)纳米颗粒，该疫苗在近红外光照射下，不仅诱导肿瘤细胞裂解和肿瘤抗原释放，而且促进含有2-硝基咪唑的树枝状大分子结构转化为含有2-氨基咪唑的树枝状大分子，通过TLR7激活DC信号通路. 其能够有效抑制原发性和异位肿瘤生长，并诱导强烈的抗原特异性免疫记忆效应，以防止体内肿瘤转移和复发，对于多种肿瘤表现出了非常强的治疗效果[68].

4.2 非共价策略来增强抗原的免疫原性

通过组装以非共价策略来制备佐剂材料是另外一种增强抗原及佐剂免疫原性的方式. 这一策略的好处是可以使用廉价可获得的初始材料来制造新的佐剂材料，并且可以通过实现疫苗递送的靶向性而降低现有小分子佐剂的毒性. 例如：TLR7/8激动剂咪喹莫特因注射后的系统毒性而影响了其作为疫苗佐剂的临床转化，而脂质衍生咪喹莫特并吸附于铝佐剂上的3M-052佐剂的安全性则能够得到保障，其作为流感预防性的疫苗研究已经进入临床试验. 这显示了利用自组装的纳米材料提升现有佐剂能力方面的巨大潜力[69,70].

常见的自组装纳米递送系统如脂质体、脂质纳米颗粒、胶束、聚合物囊泡等在近年来用于药物传输方面吸引了大量的关注. 这些纳米递送体系具有自组装稳定、制备工艺成熟、生物安全性良好、能够稳定装载所担载的药物并随时间可控释放等独特优势；且由于其具有两亲性质，既可以装载疏水药物分子，也可以装载亲水药物分子. 例如：基于脂质纳米颗粒的mRNA新冠疫苗mRNA-1273已经在2021年获得批准；在这一体系中，Baden等制备了可离子化的脂质纳米载体封装的mRNA疫苗，并进行了一系列临床试验. 研究证明，这种疫苗在内吞进入细胞后，可以保护mRNA免于被降解，能够帮助mRNA实现向细胞质中的逃逸[71,72]. 相比于脂质体和脂质纳米颗粒，基于高分子材料的胶束或高分子囊泡具有更好的稳定性. Dowling和Scott等为了解决新生儿存在的过度的免疫反应问题，开发了针对年龄特异性的疫苗制剂. 他们合成了一系列基于聚乙二醇嵌段聚丙烯硫醚的聚合物囊泡担载抗原和小分子TLR8激动剂；他们比较了不同的聚合物囊泡尺寸与疫苗免疫原性的关系，将其与减毒疫苗进行对比并发现，当聚合物囊泡的尺寸与减毒活疫苗的尺寸相当时，疫苗能够产生最强的固有和获得性免疫响应[73].

免疫佐剂材料担载免疫活性物质所形成纳米组装体的物理化学性质对于最终的疫苗产生的免疫刺激活性和生物安全性具有重要影响. 例如：纳米粒子的尺寸会影响颗粒到达淋巴结的方式：大的颗粒(>500 nm)会在注射部位形成抗原储库，并等待组织中的APCs来吞噬和加工抗原；小的颗粒(<100 nm)则可以快速回流到淋巴结并被淋巴结内的APCs加工呈递；可溶的抗原或佐剂(<10 nm)则会快速进入血液循环，引发脱靶副作用[74~76]. 除了尺寸影响，相同尺寸纳米颗粒的形状、电荷、表面形貌等也会对免疫响应产生影响. 例如：Mitragotri及其课题组的成员证明了纳米粒子的形状在抗原的吞噬和加工过程中扮演着重要角色：小尺寸的、球形的粒子(类似于天然病原体结构的)往往表现出更高效地被APCs吞噬的效率；相反，高纵横比的材料会导致较差的细胞内吞和细胞损伤(可能是由于导致NLRP3炎性小体的活化)[77,78]. 除此之外，电荷也能够影响高分子免疫佐剂的活性. 阳离子聚合物如聚乙烯亚胺(PEI)、聚(2-氨乙基丙烯酸甲酯) (PAEMA)、聚(N,N′-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸甲酯)(PDMAEMA)、聚精氨酸等已被用于与带有负电荷的PRR激动剂如CpG(TLR9激动剂)、Poly(I:C)(TLR3激动剂)等复合并提升细胞内吞和胞质传输. 这些阳离子聚合物能够帮助实现更加有效的胞质传输、增加抗原交叉呈递向MHC-I及CTL response的发生，以及实现mRNA或DNA的基因或疫苗递送等. 此外，聚合物材料的表面纹理对于免疫活性也是有影响的. 例如：Kurt-Jones的研究组证实具有粗糙表面的聚苯乙烯纳米颗粒能够比具有平滑表面的粒子引发更强的免疫刺激活性及中性粒细胞的浸润[79]. 谢曦及其小组的工作以微生物表面的拓扑特征对免疫反应的影响为灵感，制备了具有纳米尖刺的装饰的微粒，证明了纳米尖刺对细胞施加机械应力，能够导致吞噬过程中巨噬细胞和DC中的钾外流和炎症小体激活，进而显著增强抗原特异性体液和细胞免疫反应，并引发针对肿瘤生长和流感病毒感染的保护性免疫[80]. 更多参数对于免疫活性影响，仍然是值得研究的问题.

中山大学陈永明课题组开发了一种快速纳米络合(FNC)技术，用于制备治疗性纳米疫苗. 首先，为了治疗人类慢性乙型肝炎，陈永明课题组开发了一种基于壳聚糖-肝素的治疗性纳米疫苗，这种疫苗包括载有重组乙型肝炎表面抗原HBsAg (rHBsAg)和CpG的纳米疫苗(NSG)以及载有重组乙型肝炎核心抗原HBcAg (rHBcAg)和CpG的纳米疫苗(NCG). 实验结果证明，联合给药的纳米疫苗可以打破免疫耐受，实现HBsAg血清清除和抗HBsAg抗体(HBsAb)血清转化，并在HBV携带小鼠中诱导有效的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应[81]. 由于半柔性蠕虫状纳米粒子在穿过淋巴管内皮细胞和穿透淋巴结内的细胞外基质 (ECM) 到达运输中的免疫细胞方面表现出的独特特性，陈永明课题组设计了一种蠕虫状纳米佐剂控制疫苗，这种疫苗采用载有CpG的定制大小和纵横比的聚合物分子刷作为纳米佐剂，并证明这种定制佐剂的纳米疫苗更容易内化到APC中，并在TLR9所在的晚期内涵体中积累[82]. 为了实现纳米粒子在淋巴结中的长时间保留，使抗原或分子佐剂延长释放，作者进一步设计了一种单宁酸(TA)修饰的TLR7/8激动剂咪喹莫特纳米疫苗. 经TA修饰的纳米粒子增加了疫苗向淋巴结中转移性肿瘤部位的递送，在那里肿瘤相关抗原被释放并由导管衬里的DC呈递以激活T细胞. 沉积到淋巴结导管的纳米粒子在预防三阴性乳腺癌细胞的淋巴血管侵袭和随后的肺转移方面表现出了优异的性能[83]. 为了解决CpG激动剂在给药后引发的全身毒性问题，作者团队使用FNC技术，将生物相容性鱼精蛋白和三聚磷酸盐(TPP)通过物理交联生成纳米颗粒，并将CpG封装在鱼精蛋白和TPP的物理交联网络中. 实验结果表明，纳米佐剂可以将CpG重定向到引流淋巴结中，以减少全身扩散，从而提高安全性[84].

除了预先自组装成纳米结构以外，基于聚合物的微球、宏观植入件或水凝胶也被用作新型的免疫佐剂材料[85~89]. 2020年，马光辉研究组报道了一种用于高性能癌症疫苗接种的新型自愈微胶囊制剂. 首先将抗原分子以后扩散方式加载到基于聚乳酸(PLA)的微球中，再通过密封过程使微球表面的孔隙愈合，得到载有抗原的微胶囊. 接种疫苗后，这些微胶囊能够留在注射部位并形成抗原库. 伴随着微胶囊降解和抗原的持续释放，APC募集可以得到有效实现，进而使抗原内化持续增加. 其次，微胶囊降解产生的乳酸创造的酸性环境进一步促进了抗原的吸收、交叉呈递、APC招募和APC激活，使得这些APC归巢于淋巴结并持续诱导T细胞攻击肿瘤细胞[90]. Mooney及其同事使用聚(丙交酯-乙交酯)和生物活性分子(GM-CSF和CpG-ODN)进行研究，设计了一种能够用于规划和控制体内各种类型细胞运输的载体材料[91]. 他们希望设计的高分子佐剂不仅能作为药物传递装置，而且作为一个物理的抗原提呈结构，使树突状细胞能够被招募到其中，且在被激活时能驻留于此. 也就是说，使构建的疫苗可以作为一座“仓库”(depot)，缩减疫苗治疗的时间、费用和繁琐的流程，实现在不需要多次注射和高药物负荷的情况下达到良好的治疗效果. 我们围绕这一问题也进行了相关研究，基于我们之前报道的动态共价水凝胶技术[87,92]，我们提出了一种个性化癌症疫苗开发策略，即基于动态共价水凝胶的疫苗(DCHVax)，将氧化葡聚糖和八臂氨基聚乙二醇混合在一起制备水凝胶，并在此过程中将蛋白抗原和佐剂加载到水凝胶中，用于术后肿瘤治疗，由于该系统能够持续稳定缓释所担载的抗原和佐剂，延长免疫刺激所维持的时间，有效地激活了抗肿瘤免疫响应，在几种小鼠肿瘤模型中都有效抑制了残留肿瘤的术后生长[93].

在疫苗作用过程中，抗原持续释放时间情况往往会决定疫苗所产生的免疫效果. 例如：Appel研究组报道的聚合物-纳米颗粒水凝胶系统，包含十二烷基修饰的羟丙基甲基纤维素为基质担载PEG-PLA纳米颗粒[94]. 这一系统可以担载亲水及疏水的药物并具有剪切变稀性质，可以经注射器注射进入体内. 当担载亲水模型抗原蛋白及疏水的TLR3激动剂时，其可以表现出储库效应而在注射部位持续缓释达1周左右，从而在不经加强针的情况下可以维持抗体响应达90天以上. 这种局部缓释剂型可以增强疫苗的依存性和疫苗使用的简便性，通过控制抗原及佐剂的缓释时长和动力学，可以进一步加强疫苗的免疫效果. 在2021年，Appel研究组进一步开发了一种可注射的聚合物纳米颗粒(PNP)水凝胶系统，用于疫苗抗原货物RBD的持续递送[95]. 具体来说，作者使用了混合疏水改性的羟丙基甲基纤维素衍生物(HPMC-C12)和由聚(乙二醇)-b-聚(乳酸)制成的可生物降解聚合物纳米粒子(NP)制备了温和稳定、便于注射、快速自愈且具有足够屈服能力的水凝胶疫苗载体，并担载RBD抗原，证明了该疫苗佐剂系统能够很好地解决由于RBD体积小而造成的低效的淋巴吸收问题，增强RBD与关键免疫细胞的相互作用，并显著提高了体液免疫的激活水平. 康奈尔大学的马明林小组也进行了相关的研究[96]. 作者报告了一种高亲和力可注射水凝胶支架，通过程序分析聚合物的晶体结构与RBD侧链官能团之间的亲和力大小，确定使用聚(N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺)-co-(N-(三(羟甲基)甲基)丙烯酰胺) (p(APMA-THMA))制备水凝胶疫苗佐剂，用于RBD抗原的递送. 实验结果表明，该水凝胶支架能够诱导有效的生发中心(GC)反应，且该反应与RBD特异性抗体的产生和强大的1型T细胞反应相关. 这证明了除了作为持久的RBD储存器外，该水凝胶支架还成为先天免疫细胞激活的局部位点，实现更简单，更强烈的免疫反应.

5 结论与展望

疫苗是人类医学史上最伟大的发明之一. 1798年，英国医生爱德华·詹纳通过接种牛痘帮助人类预防天花，开启了现代疫苗科学[97]；二百多年来，全球已经批准了92种疫苗，用于预防24种病毒和16种细菌的感染和复发. 疫苗技术的出现大大延长了人类的平均寿命，也使得大规模的城市人口聚集成为可能. 佐剂是指能够增强免疫应答或改变免疫应答类型的物质. 作为疫苗的重要组成部分，佐剂能够激活抗原提呈细胞、保护抗原免被降解、提升抗原的传输效率等，为疫苗抗原发挥预防和治疗作用发挥了关键作用. 时至今日，疫苗的概念正在从预防性疫苗向治疗性疫苗如肿瘤疫苗、自体免疫疾病疫苗、代谢病疫苗等方向进展，疫苗抗原的类型也在从传统的减毒或灭活病原体向重组蛋白、多肽、mRNA等亚单位抗原类型转变[20]. 尽管这些亚单位抗原更加精确和安全，但是其免疫原性和稳定性也随之降低，这就使得佐剂材料的运用在现代疫苗技术中起到越来越重要的作用. 此外，现有疫苗技术在很多感染与疾病面前仍然无能为力，疫苗的给予途径可能也会对疫苗刺激产生的免疫效力带来重要影响[98,99]，而这些都依赖于新型佐剂材料的发展.

高分子免疫佐剂材料，是通过高分子材料来提升免疫佐剂的安全性和有效性，或者设计全新的具有免疫刺激活性的大分子佐剂，有望解决现有小分子免疫佐剂存在的免疫副作用大、临床应用受限的问题，这对于疫苗及新型肿瘤免疫疗法的发展都至关重要. 然而，由于疫苗应用的广泛性，新型佐剂材料的批准需要慎之又慎，这也是目前全球仅有6款佐剂材料获得批准应用的原因. 但是我们也看到，随着亚单位抗原越来越广泛的运用，佐剂材料已然成为限制新疫苗技术发展的一个关键因素，也必将迎来飞速发展和巨大需求. 因此，新型佐剂材料的快速发展和批准在未来一定是更加值得期待的.