基于聚合物刷微图案的生物素化梯度表面制备研究

三(2-苯基吡啶)合铱(Ir(ppy)₃)：纯度>98%，武汉卓鑫科技公司；(11-(2-溴-2-甲基)丙酰氧基)十二烷基三氯硅烷：纯度>95%，GELESF公司；低聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯(OEGMA，纯度>99%，分子量500)、DBCO标记的生物素(DBCO-PEG4-Biotin，纯度>95%)、叠氮化钠(NaN₃，纯度>99.5%)：西格玛奥德里奇有限公司；二甲基甲酰胺(DMF，纯度≥99.9%)、2-溴异丁酰溴(BiBB，纯度≥98%)：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；三乙胺、甲苯、硫酸（H₂SO₄，浓度98%）、碳酸氢钠(NaHCO₃，纯度≥99%)、无水硫酸镁(MgSO₄，纯度≥98%)：国药集团化学试剂有限公司；去离子水、无水乙醇、丙酮、双氧水(H₂O₂)、四氢呋喃(THF，纯度≥99.8%)、二氯甲烷(CH₂Cl₂，纯度≥99.6%)、4Å分子筛(球形，直径2~3 mm)：上海泰坦科技股份有限公司；牛血清蛋白(BSA)：上海毕得医药科技有限公司；546纳米链亲和素荧光团(streptavidin-Alexa Fluor 546)：赛默飞世尔科技(中国)有限公司；磷酸盐缓冲液(PBS)：pH=7.4，上海麦克林生化科技有限公司；硅片：100 nm氧化层，尺寸1.0 cm×0.6 cm，苏州晶硅科技有限责任公司. 所有的溶剂在使用前经过4Å分子筛除水.

用于光束图案化的DMD投影系统由激光光源(455 nm，3 W)、扩束镜、均光镜、空间光调制器DMD (分辨率为1920×1080，微镜尺寸为7.6 μm × 7.6 μm)及DMD控制器、投影镜头、分光镜、CCD相机、计算机以及载物台组成，如图1所示. DMD芯片表面包含成千上万紧密排列的可以沿+12°或-12°方向偏转的微小正方形反射镜片(又称微镜). 光源发出的光束经扩束镜、均光镜整形后照射到DMD芯片表面，借助计算机将数字灰度图像以位图文件格式(BMP)加载到DMD控制器，DMD控制器根据位图文件信息产生脉冲信号控制DMD表面不同区域微镜的偏转方向进而控制光反射，入射光经DMD调制后形成与数字灰度图像相对应的光束图像，并经投影镜头投影于基体材料表面. 在投影镜头与基体材料之间设置一分光系统，使得从基体表面反射回来的图案化光束经分光镜再次反射后进入CCD相机，最后被CCD相机捕获并传输到计算机. 通过观察图像清晰度可以实现系统的准确对焦并对聚合反应过程进行实时监测.

  

Fig. 1  Schematic of DMD-based patterning projection system.

在氮气氛围下，将BiBB (13.6 mL，0.11 mol)逐滴加入三乙胺(20.77 mL，0.149 mol)、THF(150 mL)和OEGMA (45.5 mL，0.1 mol)混合溶液中. 将所得溶液置于冰水浴中反应1 h至白色沉淀生成，之后在25 ℃水浴中反应48 h. 反应结束后，采用体积比1:1的饱和NaHCO₃水溶液清洗所得混合溶液，并用体积比1:1的CH₂Cl₂/THF溶液萃取分离3次. 所得有机层溶液用无水MgSO₄干燥2 h，之后在35 ℃下减压蒸馏去除DMF及CH₂Cl₂，所得棕黄色黏稠液体为末端含溴基团的单体2-(2-溴-2-甲基丙氧基)甲基丙烯酸乙酯(BIBEMA). 然后将所得BIBEMA单体、NaN₃ (0.0025 mmol)和DMF (10 mL)溶液加入长颈瓶并用磁力搅拌器混合均匀. 在氮气氛围下将所得混合溶液置于45 ^oC的油浴中反应24 h. 反应结束后，采用体积比1:1的饱和NaHCO₃水溶液清洗所得混合溶液，并用体积比1:1的CH₂Cl₂/THF溶液萃取分离3次. 所得有机层溶液用无水MgSO₄干燥2 h，之后在35 ℃下减压蒸馏去除DMF及CH₂Cl₂，所得棕黄色黏稠液体即叠氮功能化单体2-(2-叠氮-2-甲基丙氧基)甲基丙烯酸乙酯(AMEMA). 采用核磁共振仪(Bruker DPX 400 MHz)对AMEMA单体的化学结构进行表征，得到不同结构H原子和C原子对应的化学位移如下：¹H-NMR (DMF-d₇, TMS, δ): 6.10~5.71 (s, m, 2H, CH₂＝C(CH₃)CO―), 4.39~4.23 (m, 4H, (―COOCH₂CH₂)₂), 3.83~3.59 (s, 34H, ―‍(CH₂O-CH₂)₉―), 1.94 (s, 2H, CH₂＝C(CH₃)CO―), 1.49 (s, 5H, ―COC(CH₃)₂N₃); ¹³C-NMR (DMF-d₇, TMS, δ): 172.51 (―C＝OC(CH₃)₂N₃), 166.78 (CH₂＝C―(CH₃)C＝O―), 136.43 (CH₂＝C(CH₃)―), 125.36 (CH₂＝C(CH₃)―), 70.42 (―(OCH₂CH₂)_n―), 68.76 (d, J=131.4 Hz, ―OCH₂CH₂―), 64.99~63.39 (―OCH₂CH₂OCO―), 56.60 (―C(CH₃)₂N₃), 24.67 (―C(CH₃)₂N₃), 17.73 (CH₂＝C(CH₃)―).

首先将硅片浸入丙酮溶液中超声清洗5 min，之后用无水乙醇、去离子水、无水乙醇依次清洗硅片并在氮气流下干燥. 然后将清洗好的硅片置于“食人鱼溶液”(即30% H₂O₂和70% H₂SO₄的混合溶液，该溶液具有强腐蚀性且在过量有机物存在下会有爆炸危险，操作需注意规范及安全)中并在90 ℃的油浴下加热处理3 h. 最后用防腐蚀镊子取出硅片，用大量去离子水、无水乙醇冲洗其表面后在氮气流下干燥即得到表面羟基化的硅片. 配制0.08 mol/L包含(11-(2-溴-2-甲基)丙酰氧基)十二烷基三氯硅烷(引发剂)、甲苯、三乙胺的反应溶液，将表面羟基化的硅片置于溶液中(确保基体材料完全浸入溶液中)避光反应12 h (氮气氛围)，反应结束后采用丙酮、无水乙醇、去离子水清洗硅片并在氮气流下干燥，得到接枝引发剂的硅片.

首先在Schlenk瓶中配置催化剂浓度和单体浓度分别为0.92 mmol/L和1.16 mol/L的AMEMA/Ir(ppy)₃/DMF反应溶液，经过3次冷冻循环脱气后取40 µL所得溶液滴加在接枝引发剂的硅片表面并覆盖厚度125 µm的盖玻片形成均匀液膜，然后将硅片置于DMD图案化投影系统载物台上，调整载物台高度确保硅片表面处于投影系统的焦点处. 根据需要绘制数字灰度图像并将其以位图文件格式加载到DMD控制器，DMD微镜在DMD控制器作用下朝不同方向偏转以对入射光进行调制，调制后的光束经投影镜头投影于均匀覆盖反应溶液的硅片表面形成由明场和暗场构成曝光图像以选择性引发聚合反应. 图2为DMD光调控引发表面ATRP反应在硅片表面制备PAMEMA聚合物刷微图案的示意图. 反应10 min后，依次用无水乙醇、去离子水清洗硅片表面并在氮气流下吹干，得到聚合物刷图案化的硅片，所得材料储存于干燥皿中用于表征测试.

  

Fig. 2  Schematic of the fabrication of micropatterned PAMEMA brushes via DMD-modulated Photo-ATRP reaction.

首先将接枝了PAMEMA聚合物刷微图案的硅片浸入PBS缓冲液中振荡清洗2次(每次10 min)，然后将其转移至10 μmol/L的DBCO-PEG4-Biotin/PBS溶液中进行生物素化，室温振荡反应6 h后，用无水乙醇、去离子水循环清洗硅片并在氮气流下干燥；之后将生物素化的硅片浸入5%的BSA/PBS溶液中振荡1 h，以阻断非特性蛋白吸附；之后将硅片转移至0.01 mg/mL的streptavidin-Alexa Fluor 546/PBS溶液中，室温振荡反应2 h；最后采用PBS溶液清洗硅片2次(每次20 min)后储存于PBS溶液中以备激光共聚焦显微镜测试. 所有反应在避光条件下进行.

采用舜宇恒平科学仪器有限公司RX50M光学显微镜对PAMEMA聚合物刷图案化表面进行观察并拍摄图像，放大倍数为5倍. 采用美国ZYGO公司NewView 8000型光学表面轮廓仪对PAMEMA聚合物刷微图案的三维结构进行表征，测试方法为3D相干扫描干涉法. 采用系科光电科技有限公司RISE Zenith V型椭圆偏光仪对聚合物刷的厚度进行表征，使用He-Ne激光探头(λ =632.8 nm)，在入射角70°、75°和80°下测试. 采用美国PHI公司PHI5000 X射线光电子能谱仪(XPS)对PAMEMA聚合物刷的化学组成进行表征，使用铝/镁靶，在高压14.0 kV，功率250 W，真空度大于1.333×10³ Pa条件下测试；通过RBD147数据采集卡和Auger Scan3.21软件获取数据，采用Casa XPS软件对所得数据进行定量分析. 采用尼康公司Nikon A1R激光共聚焦显微镜(Ti显微镜头)对PAMEMA聚合物刷图案化硅片表面的荧光图案进行观察并拍摄，放大倍数为20倍，采用NIS-Elements Viewer软件进行图像处理. 采用IONTOF公司飞行时间二次离子质谱仪(ToF-SIMS)对PAMEMA聚合物刷图案化表面的化学组成分布进行测试，主要离子束为循环时间为100 μs、脉冲宽度为100 ns的35 keV Bi³⁺离子束；扫描面积为500 μm × 500 μm，像素尺寸为512×512.

图3(a)为DMD光调控引发表面ATRP制备聚合物刷微图案时CCD相机获取的图案化光束激发基体材料表面反应溶液产生的荧光图像. 图3(b)为PAMEMA聚合物刷图案化硅片表面的光学显微镜图像，图中可以观察到明显的具有亮度反差的方形图案，表明PAMEMA聚合物刷在硅片表面选择性生长. 图3(c)为所制得的聚合物刷微图案的3D形貌图像，结合椭圆偏光仪测得的聚合物刷膜厚和微图案3D形貌得到图案化聚合物刷的厚度轮廓曲线(电子支持信息图S1)，结果表明制备得到的图案化PAMEMA刷的厚度约为27 nm，在光学显微镜图像(图3(b))中较暗区域为接枝引发剂表面，较亮区域为接枝PAMEMA聚合物刷表面. 比较荧光图像、光学显微镜图像和3D形貌图像可知，PAMEMA聚合物刷生长区域对应荧光图像的明场区域，引发剂区域对应荧光图像的暗场区域，这是因为在明场区域，光辐照Ir(ppy)₃引发表面ATRP反应生成PAMEMA聚合物刷，而在暗场区域，没有光辐照的条件下Ir(ppy)₃无法引发表面ATRP反应. 图3(d)~3(f)为制备得到的各种形状PAMEMA聚合物刷微图案的光学显微镜图像，边界清晰且完整的复杂图案表明DMD光调控引发表面ATRP技术不仅适用于形状简单微图案的制备，在制备形状相对复杂的聚合物刷微图案时依然能够取得较好的效果.

  

Fig. 3  (a) Exposure image projected onto the substrate surface covered with monomer/catalyst solution; (b) Optical image from the silicone substrate with PAMEMA brush micropatterns; (c) 3D topography image of the obtained PAMEMA brush micropatterns; (d-f) Optical images of PAMEMA brush micropatterns with various complicated shapes.

图4(a)为接枝PAMEMA聚合物刷硅片表面的XPS高分辨率C1s元素分谱图. 由图可知，在288.6、286.3和284.8 eV谱峰处对应的O―C＝O、C―O/C―N和C―C/C―H结构^[24]的谱峰强度比例分别为8.6%、70.1%、21.3%，与AMEMA单体中对应基团的比例基本一致. 进一步采用TOF-SIMS对PAMEMA聚合物刷图案化表面化学组成分布情况进行表征. 图4(b)和4(c)分别为PAMEMA刷图案化表面Si^-和N₃^-离子片段的高分辨率TOF-SIMS扫描图像，图中观察到明显的具有信号强度反差的2个区域. 参照PAMEMA聚合物刷微图案的光学显微镜图像(图3(b))可知，在引发剂区域检测到大量对应于硅基体表面二氧化硅氧化层的Si^-离子片段，而PAMEMA聚合物刷微图案区域则检测到明显的对应PAMEMA刷末端叠氮结构的N₃^-离子片段. 以上结果表明通过在基体材料表面制备PAMEMA聚合物刷微图案可以实现具有叠氮基团反差特性的图案化表面的成功制备.

  

Fig. 4  (a) XPS high resolution C1s spectra of PAMEMA brushes grafted silicon substrate; (b, c) TOF-SIMS mapping images of Si^- fragments and N₃^- fragments from PAMEMA brushes patterned silicon substrate.

叠氮基团与DBCO之间的高特异性点击反应赋予PAMEMA聚合物刷微图案作为功能化模板以固定各种材料(如生物分子、纳米粒子等)的能力^[25,26]. 本文借助DBCO修饰的生物素对各种形状PAMEMA聚合物刷微图案表面功能化特性进行研究. 如图5(a)所示，以叠氮基团为反应位点，通过点击反应将DBCO修饰的生物素分子锚固到PAMEMA聚合物刷微图案表面，然后借助生物素和链霉亲和素之间的特异性结合实现荧光标记的链霉亲和素在生物素化表面黏附. 图5(b)~5(d)为不同形状PAMEMA聚合物刷图案化硅片表面经点击反应和链霉亲和素特异性结合后的荧光图像，图中可观察到不同形状的红色荧光图案，每种图案都具有非常清晰的边界，表明链霉亲和素分子在微图案区域的黏附，间接表明生物素分子的区域选择性分布.

  

Fig. 5  (a) Schematic of "click" immobilization of biotins to the PAMEMA brushes through the highly specific orthogonal reactivity between azido groups and dibenzocyclooctyne (DBCO) groups and subsequent streptavidin-fluorophore conjugate binding. (b-d) Fluorescence images of the obtained biotinylated surfaces with various shapes after streptavidin-Alexa Fluor 546 binding.

进一步研究图案化PAMEMA聚合物刷结构参数对表面固定生物素分子空间分布的影响. 设计图6(a)所示的包含不同灰度值同心正方形图案的数字灰度图像，通过DMD图案化投影系统的灰度曝光方式产生包含不同区域曝光强度的曝光图案(图6(b))以引发聚合反应制备PAMEMA聚合物刷微图案. 图6(c)和6(d)分别为制备得到的PAMEMA聚合物刷微图案的3D形貌图像及厚度分析曲线，由图可知区域灰度值差异将导致聚合物刷厚度的变化，从而实现台阶结构聚合物刷微图案的制备. 厚度分析表明，在低灰度值下，PAMEMA刷的厚度随灰度值增加而显著增大，这是因为灰度值越大意味着光照强度越高，激发产生的自由基数量越多，从而提高ATRP聚合反应速率. 当灰度值超过一定值时，反应溶液中自由基浓度趋于饱和，ATRP聚合反应速率不再发生变化，PAMEMA刷的厚度也不再发生变化. 图6(e)和6(f)分别为具有台阶结构的PAMEMA聚合物刷微图案表面经点击反应和链霉亲和素特异性固定后的荧光图像及荧光强度分析曲线. 图中可以观察到荧光强度由边缘向中心呈阶梯状增大的荧光图案，间接表明生物素分子在PAMEMA聚合物刷微图案表面的分布密度由边缘向中心逐渐增大，这是因为PAMEMA刷越厚的区域，其表面叠氮基团密度越大，则点击固定的生物素分子数量越多. 以上结果表明，通过控制PAMEMA刷的厚度可以对其表面锚固生物素分子的空间分布进行调控以制备具有密度变化的生物素化表面. 图6(g)~6(h)为具有不同台阶结构的PAMEMA聚合物图案化表面经生物素分子锚固及链霉亲和素染色后的荧光图像，各种形状微图案表面明显的荧光强度变化表明以叠氮功能化聚合物刷微图案为模板制备复杂结构生物素化梯度表面的能力.

  

Fig. 6  Designed digital grayscale image (a) with different gray values for fabricating PAMEMA brush micropattern and corresponding exposure image (b). 3D topography image (c) and corresponding height analysis (d) of the obtained PAMEMA brush micropattern. Fluorescence image (e) and corresponding fluorescence intensity profile (f) of pyramid PAMEMA brush micropattern with biotin immobilization and streptavidin-Alexa Fluor 546 binding. (g, h) Fluorescence images of biotinylated gradient surfaces in arbitrary complex shapes after streptavidin-Alexa Fluor 546 staining.