三元共轭聚合物用于NIR-II荧光成像及光热/光动力联合治疗

2,6-二(三甲基锡)-4,8-二(5-(2-乙基己基)噻吩基-2-)-苯并二噻吩购自赛乐新材料科技有限公司. 3,6-双(5-溴噻吩-2-基)-2,5-双(2-辛基十二烷基)-2,5-二氢吡咯并[3,4-c]吡咯-1,4-二酮购自纳凯科技有限公司. 3,8-二溴1,10菲罗啉和四三苯基膦钯购自萨恩化学技术有限公司. 细胞实验的所有材料均从南京凯基生物技术有限公司购买. 实验中使用的溶剂等其他材料均为直接购买，无需进一步纯化.

BDP合成路线如图1所示. 将2,6-二(三甲基锡)-4,8-二(5-(2-乙基己基)噻吩基-2-)-苯并二噻吩(0.05 g，0.055 mmol)、3,‍8-二溴1,10菲罗啉(0.0093 g，0.0276 mmol)、3,6-双(5-溴噻吩‍-2-基)-2,5-双(2-辛基十二烷基)-2,5-二氢吡咯并[3,4-c]吡咯-1,4-二酮(0.028 g，0.0276 mmol)和四三苯基膦钯(20 mg)加入到Schlenk瓶(100 mL)中，抽真空鼓氮气10 min. 加入10 mL无水甲苯作为溶剂，110 ℃反应24 h，冷却后用饱和食盐水萃取，有机相旋干后用甲醇洗涤3次，抽滤烘干，得黑色固体粉末(产率73%)，在Ultra Shield Plus，Bruker 400 MHz NMR上表征获得核磁共振氢谱，通过凝胶渗透色谱测定BDP分子量，仪器型号为Shim-pack GPC-80X型. 结构表征见电子支持信息图S1和S2.

  

Fig. 1  Schematic illustration of BDP preparation.

将BDP (1 mg)溶于THF (2 mL)中，然后将溶液快速加入到F127 (20 mg)的超纯水溶液(8 mL)中，用超声仪震荡5 min. 鼓吹氮气1 h以去除THF，过滤得到深绿色的BDP NPs水溶液.

BDP NPs的粒径大小及形貌分别通过动态光散射仪(ALV/CGS-3，DLS)和HT-7700型透射电子显微镜(TEM)来测定. 将制备好的BDP NPs水溶液直接用于DLS表征. 而TEM样品则是将BDP NPs水溶液滴至铜网，于通风橱自然风干过夜后可用于测试. UV-Vis-NIR吸收光谱通过Shimadzu UV-3600 Plus型号仪器测得，近红外二区荧光光谱通过型号为Horiba Fluorolog 3型荧光光谱仪获得.

使用产自Estonia的FLIR E50型红外热成像相机测量BDP NPs的光热转换性能. 用730 nm激光(1 W/cm²)照射不同浓度的NPs. 此外，将150 μg/mL的NPs用不同功率密度的730 nm激光照射.

将DPBF的乙醇溶液(2×10^-5 mol/L)加入BDP NPs溶液中(1 mL，1×10^-5 mol/L)，用不同功率密度(0~0.75 W/cm²) 的730 nm激光照射样品，利用UV-Vis-NIR 分光光度计测得其吸收光谱.

NIH3T3细胞和Hela细胞在DMEM培养基中孵育. MTT法用于评估BDP NPs对正常细胞NIH3T3和Hela细胞的生物毒性. 将NIH3T3或Hela细胞与不同浓度的NPs在96孔培养板中培养24 h然后测试暗毒性. 对于光毒性，Hela细胞在与NPs孵育后用730 nm激光(0.75 W/cm²)照射5 min. 然后加入MTT (20 μL，500 μg/mL)溶液共培养. 去除含有MTT的培养基后，添加100 μL二甲基亚砜(DMSO)溶液溶解MTT formazan晶体，然后使用微孔板读取器(Bio-Rad Laboratories，Hercules)在490 nm波长下分析产物的吸光度. 本实验采用Hela细胞进行活死细胞检测，细胞培养方法参照上述方法. 将培养好的Hela细胞与钙黄绿素共同孵育以标记活细胞，用细胞碘化丙啶(PI)标记死亡细胞10 min. 用倒置荧光显微镜记录相关细胞图像.

将配置好的BDP NPs水溶液(200 μL，2 mg/mL)通过尾静脉注射到小鼠体内，在不同时间点采用近红外二区荧光成像仪进行实时NIR-Ⅱ荧光成像，激发波长为808 nm，激光功率80 mW/cm²，滤光片为980 nm长通滤光片.

通过对BDP NPs进行TEM表征，可以确定BDP NPs的粒径约为90 nm，与所测试得的DLS数据一致(图2(a)). 此外，BDP NPs储存5周后粒径大小也无明显变化，表明在水和PBS中具有出色的稳定性(图2(b)). 接下来对 BDP NPs的光学性质进行研究.如紫外吸收/荧光发射光谱所示，所制备的纳米颗粒主要吸收峰为735 nm，发射峰值在1039 nm，较BDP的四氢呋喃溶液有一定红移(图2(c)). 通过对BDP NPs进行光稳定性测试，测试结果显示，与FDA批准染料ICG相比，在730 nm激光照射(0.75 W/cm²，60 min)后，BDP NPs显示出极好的光稳定性(图2(d)). 同时 BDP NPs具有较高的质量消光系数(4.67 mL/mg/cm，电子支持信息图S3)，表明该纳米探针具有较强的近红外光吸收能力. 此外，使用IR26染料的1,2,-二氯乙烷(DCE)溶液作为参考标准，测量了BDP NPs的NIR-II荧光量子产率(QY). 首先分别测试不同吸光度下，BDP NPs水溶液及IR26溶液的荧光光谱，并在900~1500 nm范围内积分计算相应吸光度下的总发射强度(电子支持信息图S4). 接着，绘制积分荧光强度与样品吸光度的曲线，通过线性拟合求得2种物质对应曲线的斜率. 最后，利用公式(1)，计算得BDP NPs水溶液中的QY为0.62%.

  

Fig. 2  (a) DLS data and TEM image of BDP NPs; (b) Particle size stability of BDP NPs; (c) Absorption/fluorescence spectra of THF solution of BDP and BDP NPs; (d) Photo-stability of BDP NPs.

其中QY为对应物质的荧光量子产率，slope为相应积分荧光强度-吸光度曲线的斜率，n为溶剂的折射率. 该数值能够较好地满足活体成像的需求. 综上所述，BDP NPs具有出色的光学性质，有利于生物医学成像应用.

在730 nm激光照射下来测试BDP NPs的光热性能. 如图3(a)所示，BDP NPs溶液的温度变化与激光功率密度成正比. 激光功率保持不变的情况下，BDP NPs溶液升到的最高温度随浓度的升高而升高(图3(b)). 在激光的持续照射下，浓度为150 μg/mL的BDP NPs溶液的温度从25 ℃升高至64 ℃. 相同条件下，水的温度升高极少，这与红外热像仪的数据相对应(图3(c)). 通过730 nm激光照射BDP NPs溶液(光照/冷却4次循环)来评估其光热稳定性(图3(d))，溶液上升到的最高温度几乎保持不变，说明BDP NPs在激光照射下有良好的光热稳定性. 接下来，按照文献中的方法^[13]，测试 BDP NPs的光热转换效率. 经计算，BDP NPs的光热转换效率约为18.2%.

  

Fig. 3  (a) The heating curves of BDP NPs under different power of 730 nm laser irradiation; (b) The heating curves of BDP NPs solution with different concentrations under 730 nm laser irradiation; (c) Infrared thermal images of centrifuge tubes with various concentrations of BDP NPs under laser irradiation; (d) Photothermal stability of BDP NPs.

随后，进一步测试了纳米粒子的光动力效果. 由于荧光探针DPBF可以与活性氧发生反应，导致DPBF吸光度降低，因此本研究选用DPBF作为活性氧探针. 由图4(a)~4(c)得知，随着光照时间的增加，BDP NPs和DPBF的混合溶液在414 nm处的吸收度不断降低，这表明在730 nm激光照射下BDP NPs可以产生大量活性氧. 此外，随着激光功率的增加，DPBF探针降解趋势增加(图4(d))，表明可以通过控制激光功率实现BDP NPs活性氧的产生. 此外，为了排除干扰，对单独激光照射进行了探究(图4(e))，单独激光照射8 min后也不会造成DPBF的降解，说明BDP NPs不存在的情况下不会产生活性氧. 然后在细胞层面对材料的活性氧产生能力进行测试. DCFH-DA探针能够与活性氧反应产生绿色荧光，因此选用DCFH-DA探针检测纳米粒子在细胞层面的活性氧产生. BDP NPs培育Hela细胞24 h后用激光照射，通过共聚焦成像观察到细胞呈现绿色荧光且照射6 min时明显比照射3 min时更强(图5). 而没有进行激光照射时，几乎观察不到绿色荧光，证实了BDP NPs在激光照射下可以在活细胞中产生活性氧. 以上所有数据证实: BDP NPs在激光照射下拥有良好的光热/光动力性能，可能对肿瘤具有优异的联合治疗效果.

  

Fig. 4  Absorption spectra of BDP NPs and DPBF mixed aqueous solutions at different power densities (a) 0.50 W/cm²; (b) 0.75 W/cm² and (c) 1 W/cm² of 730 nm laser irradiation; (d) The intensity changes of the absorption peak of DPBF under irradiation with different powers; (e) Absorption spectra of DPBF solution treated with NIR laser (730 nm, 1 W/cm²).

  

Fig. 5  The detection of ROS in Hela cells.

利用MTT方法对BDP NPs的生物相容性进行测试. 将不同浓度的BDP NPs溶液与NIH3T3正常细胞共培养，考察NIH3T3正常细胞的生存率. 如图6(a)所示，即使BDP NPs浓度达到125 μg/mL，NIH3T3正常细胞依然保持较好的生存率，表明该纳米粒子具有优异的生物相容性. 随后进一步对BDP NPs对癌细胞的细胞毒性进行测试. 首先用不同浓度的BDP NPs溶液与两组Hela细胞共培养24 h后，然后一组Hela细胞用730 nm激光照射(730 nm，1 W/cm²)，另一组Hela细胞不进行光照，继续孵育后加入MTT溶液和DMSO，最后通过酶标仪确定癌细胞生存率. 如图6(b)所示，在没有730 nm激光照射的情况下，BDP NPs对Hela细胞没有明显的毒副作用. 而在730 nm激光照射后Hela细胞生存率明显降低，表明BDP NPs具有明显的光毒性，这归因于PTT/PDT的联合治疗功效. 接下来通过活/死细胞测试BDP NPs(浓度为125 μg/mL)的治疗效果，钙黄绿素AM是一种细胞活性染料，能够染色活细胞产生绿色荧光，碘化丙啶PI能够染色死细胞，使其发出红色荧光. Hela细胞活/死分析的结论表明，BDP NPs具有较好的光疗效果(图6(c)). 以上实验结果表明，BDP NPs在激光照射下可以有效杀死癌细胞.

  

  

Fig. 6(a) Determination of the biocompatibility of BDP NPs to NIH3T3 normal cells; (b) Determination of the cytotoxicity of BDP NPs to Hela tumor cells with or without laser irradiation; (c) Live/dead cell staining analysis. The concentration of BDP NPs is 125 μg/mL.

利用Hela荷瘤小鼠对BDP NPs的NIR-II荧光成像性能进行测试. 在通过小鼠尾静脉注射BDP NPs 10 min后，使用NIR-II荧光成像仪对小鼠进行成像，如图7(a)所示，注射10 min时可以清晰地观察到小鼠全身血管，且图像具有较高的成像质量和分辨率. NPs注射进体内后，小鼠肿瘤部位荧光强度随时间逐渐增强，并在注射12 h后达到最大值，随后强度有所下降. 24 h后，还能清楚地观察到肿瘤组织，表明BDP NPs在体内具有较长时间的成像能力(图7(a)和7(b)). 最后通过NIR-II荧光成像研究了BDP NPs在离体的器官和肿瘤中的分布，如图7(c)和7(d)所示，BDP NPs主要富集在肝、脾和肿瘤处. 这些实验现象表明，BDP NPs具有较好的活体NIR-II荧光成像能力. 成像实验结束后对主要离体器官进行了切片，并用H&E染色. 实验结果如图8所示，在这些组织中未检测到明显病变，表明BDP NPs在体内无明显的毒性. 在荧光成像的测试中发现经尾动脉注射12 h后 NPs在肿瘤部位富集程度达到最高值，这为肿瘤的光疗提供了最佳治疗时间. 为了探索BDP NPs在体内进行NIR-II光疗的可行性，将荷瘤鼠分为2组通过尾静脉注射不同的制剂：(a) PBS，(b) BDP NPs，12 h后进行近红外激光照射(730 nm，1 W/cm²) 实验. 如电子支持信息图S5所示，注射BDP NPs的小鼠肿瘤部位温度显著升高，并迅速达到55 ℃ 以上，该温度足以杀死肿瘤细胞. 相比之下，只注射PBS的小鼠肿瘤部位在照射8 min后温度无显著变化. 该实验结果证明了BDP NPs有能力实现NIR-II成像引导的光疗.

  

Fig. 7  (a) NIR-II fluorescence images of BDP NPs; (b) NIR-II fluorescence intensity of tumor; (c) Fluorescence intensity of isolated organs; (d) Semi-quantitative analysis of isolated organs.

  

Fig. 8  Staining of major tissues after different treatments.