不同颜色小豆黄酮物质差异分析

摘要：本研究采用高效液相色谱技术，分析16份不同粒色小豆品种中黄酮类物质的组成与含量。结果显示，淡褐色品种AG89的儿茶素衍生物含量最高，红色品种Jingnong8的儿茶素及槲皮素衍生物3含量最高，红底黑斑品种GM633的槲皮素衍生物1含量最高。此外，芦丁仅在CCA001、Jingnong6等6个品种中检出，米白色品种Norin3、AG110未检测到该组分。基于黄酮类物质含量的主成分分析结果表明，黄酮类化合物的组成与含量均与小豆品种及种皮颜色密切相关。

　 关键词：小豆；种皮颜色；总黄酮含量（TFC）

　 小豆（Vigna angularis）是我国重要的食用豆类作物，其富含的黄酮类物质具有抗氧化、调节代谢等生理功能，是衡量小豆功能价值的核心指标[1]。小豆种皮中的黄酮类化合物为多样化群体，主要包括花青素、黄酮醇、异黄酮及原花青素等。这些化合物的组成与含量因小豆品种和种皮颜色不同而存在显著差异[2]。种皮颜色是小豆的重要表型性状，王明立等[3]通过对300余份小豆种质资源的表型鉴定发现，小豆种皮颜色变异丰富，且与驯化进程密切相关。李媛等[4]进一步研究发现，种皮颜色差异可能伴随次生代谢产物的分化，但关于不同种皮颜色小豆黄酮含量的系统研究仍较匮乏。

　 本研究以16份不同粒色小豆品种（涵盖8种种皮颜色）为材料，测定7种黄酮组分（儿茶素衍生物、儿茶素、槲皮素衍生物1-3、芦丁、牡荆素衍生物）及总含量，结合主成分分析（PCA），深入探究不同粒色小豆黄酮类物质的品种差异、组分特异性及与种皮颜色的关联性，为小豆功能型育种与功能食品开发提供数据支撑及种质资源。

　 一、材料与方法

　 （一）供试材料

　 供试的16个小豆品种均来源于多样性丰富的小豆种质资源库，由北京农学院小豆创新研究团队收集提供。

　 （二）试剂与仪器

　 高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）、质谱仪（安捷伦科技有限公司）、高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）、电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）、分析天平（感量0.0001g）、涡旋仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）、超声波振荡器（深圳市科洁超声科技有限公司）、离心机（Eppendorf Centrifuge 5804R）、甲醇（分析纯）、滤膜（0.45μm）、一次性注射器（1mL）、进样瓶（2mL）、乙腈（色谱纯）、甲酸（质谱纯）、山奈酚、牡荆素、槲皮素、儿茶素（黄酮标准品均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

　 （三）方法

　 1. 小豆样品收集

　 小豆籽粒完全成熟后收获，收获后将籽粒置于通风阴凉处自然晾干，去除破损粒、虫蛀粒及杂质。将处理后的籽粒保存于4℃冰箱，用于后续黄酮类物质提取与检测。

　 2. 黄酮类物质提取

　 将保存的小豆籽粒放入高速万能粉碎机中粉碎磨细，过100目筛，随后置于42℃电热恒温鼓风干燥箱中干燥过夜，以消除水分对提取效率的影响。精确称取干燥后的小豆粉末0.2g（精确至0.0001g），置于2mL离心管中，每个样品设置3次重复。向离心管中加入1mL 80%甲醇（分析纯），经涡旋仪涡旋处理10min，使样品与溶剂充分混合。之后将离心管置于超声波振荡器中，在40Hz条件下超声提取90min；超声结束后，将离心管放入离心机，以12000r/min的转速离心20min，小心倒出上清液至新离心管中，上清液即为黄酮类物质提取液，待检测。

　 3. 黄酮类物质检测

　 （1）总黄酮含量测定。采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法测定总黄酮含量：将芦丁标准品于42℃干燥至恒重，精确称取7.5mg，用50%二甲基亚砜溶解并定容至50mL，制成标准母液；稀释得到10、20、30、40、50、60、75μg/mL系列标准液，以50%二甲基亚砜为空白对照，在510nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线并得出回归方程。取100μL样品提取液，依次加入800μL超纯水、60μL 5% NaNO2（静置5min）、60μL 10% AlCl3（静置10min）、400μL 1mol/L NaOH，用超纯水补至2mL并混匀；以超纯水为空白对照，在510nm波长下测定吸光度，按回归方程计算总黄酮含量，结果以mg芦丁当量（RE）/g表示。

　 （2）黄酮组分定性与定量检测。 取黄酮类物质提取液，经0.45μm有机滤膜过滤后注入2mL进样瓶待上样。采用Phenomenex C18色谱柱（2.1mm×50mm，1.8μm）；流动相A为0.1%甲酸水溶液，B为色谱纯乙腈；梯度洗脱程序：5% B维持1min，9min内升至25% B，10min内升至100% B（持续至10.5min），11min恢复至5% B；流速0.3mL/min，柱温40℃，进样量2μL，检测波长254nm。对照儿茶素、槲皮素、芦丁、牡荆素标准品，结合保留时间、紫外吸收光谱及质谱数据（分子离子峰、碎片离子峰）进行黄酮组分定性；以各组分标准品绘制峰面积-浓度标准曲线，采用外标法定量，结果以mg/g表示。

　 4. 数据处理与统计分析

　 采用IBM SPSS Statistics 17（IBM Corp. USA）软件进行数据处理与统计分析。

　 二、结果与分析

（一）不同颜色小豆种皮黄酮含量的测定结果

　 黄酮类化合物具有抗氧化活性与着色能力[5]，主要以葡糖苷形式存在于小豆种皮中，其种类与含量均与小豆种皮颜色及品种相关[6]。16份小豆品种的7种黄酮组分测定结果见图1。在16个品种小豆种皮中共检测到7种黄酮组分，分别为儿茶素衍生物、儿茶素、槲皮素衍生物1-3、芦丁、牡荆素衍生物。儿茶素衍生物含量以淡褐色品种AG89最高，米白色品种Norin3最低，二者差异达13.5倍。儿茶素含量以红色品种Jingnong8最高，米白色品种Norin3仍为最低。槲皮素衍生物1含量最高值出现在红底黑斑品种GM633，显著高于其他品种（P<0.05），最低值为米白色品种Norin3；槲皮素衍生物2和3的高含量品种集中于红色种皮，其中Jingnong22的槲皮素衍生物2含量最高，Jingnong8的槲皮素衍生物3含量最高；牡荆素衍生物含量以红底黑斑品种CCA004最高，红色品种Jingnong8和灰底黑斑品种GM977最低；芦丁含量在部分品种中未检出，检出品种中以红色Jingnong23含量最高，黑色品种AG118最低。

　 图1 小豆种皮黄酮类物质含量的测定结果（mg/g）

　 （二）基于小豆种皮黄酮含量的主成分分析

为进一步探究不同粒色小豆与黄酮类物质组成及含量的关联性，明确品种间差异特征，对16个小豆品种的7种黄酮组分及总黄酮含量数据进行主成分分析（PCA），结果如图2。由图2可知，两个主成分共解释76.1%的总方差（主成分1为53.5%，主成分2为22.6%）。

　 从x轴方向看，主成分1可将16个小豆品种清晰划分为三大类群：淡褐色品种AG89、灰底黑斑品种GM977位于x轴负向区域；米白色品种Norin3、AG110及红底黑斑品种CCA004、GM633位于x轴正向区域；红色、绿色、橙色、黑色品种集中于x轴中间区域。结合图1可知，位于x轴负向的AG89和GM977，其儿茶素衍生物含量和总黄酮含量显著高于其他品种；位于x轴正向的米白色品种，黄酮组分含量均为最低，红底黑斑品种则以槲皮素衍生物1高含量为特征；中间区域品种黄酮组成更具多样性，红色品种富含槲皮素衍生物2-3，绿色品种含少量芦丁，黑色品种组分均衡，故聚集于原点附近。

　 主成分2可进一步细化中间区域品种的分类：橙色品种AG163、GM170及部分红色品种位于y轴正向区域；绿色品种CCA001、灰底黑斑品种GM977及淡褐色品种GM13位于y轴负向区域。结合图1可知，位于y轴正向的品种AG163，其牡荆素衍生物含量相对较高，且未检出芦丁；位于y轴负向的品种中，CCA001是少数检出芦丁的品种，GM977则因黄酮组分均衡但无突出高含量组分。此外，所有品种均分布于置信区间内，无异常样本，进一步验证了分类结果的稳定性。

图2 基于小豆种皮黄酮类物质的主成分分析得分图

　 三、结论

　 本研究以16份不同粒色小豆品种为材料，采用高效液相色谱技术检测7种黄酮组分含量，结合主成分分析（PCA）开展研究。结果表明，不同粒色小豆黄酮组成与含量差异显著，淡褐色、灰底黑斑及红色品种总黄酮含量显著高于其他粒色，其中AG89（淡褐色）和GM977（灰底黑斑）含量最高；组分方面，淡褐色品种富含儿茶素衍生物，红色品种富含儿茶素及槲皮素衍生物2-3，红底黑斑品种槲皮素衍生物1含量突出，芦丁仅在6个品种中检出，米白色品种未检测到该组分。PCA可清晰区分供试品种，表明黄酮组成及含量与小豆品种、种皮颜色密切相关，受遗传调控。本研究为高黄酮小豆种质筛选、功能型育种及相关功能食品开发提供了重要依据。

文章来源：《农业科技报》https://www.zzqklm.com/w/sci/26919.html