抑制性消减杂交技术在水产无脊椎动物中的应用

    自20年前，由于分子生物的迅猛发展与物种基因组全序列测定计划的逐渐结束，分子生物学的研究重心已转向表达调控功能与基因功能研究。抑制性消减杂交(SSH)技术是一种鉴定、分离、筛选组织细胞中未知基因表达的新技术，它与抑制PCR与消减杂交相结合，具有灵敏度高、操作简便、假阳率低于特异性强等优点，逐渐被学界视为应用前景最看好的一种分子生物学研究方法。

一、抑制性消减杂交(SSH)技术的原理

    抑制性消减杂交(SSH)技术是在抑制性PCR的基础上，结合消减杂交步骤与均等化检验子DNA单链步骤，简单快捷地分离差异基因的方法，即富集差异序列，消减同源序列。

    这一方法根据杂交二级动力学，使分子间原有单链DNA的丰度差异消失、DNA相对含量趋同。抑制性PCR指根据链间退火弱于链内退火并且链内退火更为稳定的动力学特性，非目的序列片段两端反向重复序列退火时分离出锅柄形态的互补结构，使其不能与引物配对与作为模板，从而选择性地使得非目的基因片段难以扩增。而在均等基因群的标准化步骤中，消减杂交能起到去除驱赶基因群和目的基因群之间的共有基因序列的作用，以正常扩增基因的不同序列。

二、抑制性消减杂交(SSH)技术的优缺点

2.1 优点：在鉴定、分离、筛选与克隆差异表达的基因序列片段中，这种方法更适用于差异表达的新基因的发现；这种方法一般情况下4天左右就能得到差异表达基因片段的cDNA，其筛选周期比较低；一次抑制性消减杂交反应就能够分离上百个差异表达基因，效率非常高；这一技术成熟、简单、易操作掌握。

2.2 缺点：这一技术对材料的要求高，所采用的材料背景差异不能过大；消减文库中cDNA不能被酶完全消化，全长的cDNA无法通过此技术获取，因此cDNA非全长；对模板需求量高，mRNA不符合要求量则很有可能将导致低丰度的cDNA难以被检测出来。

三、抑制性消减杂交(SSH)技术在水产无脊椎动物中的应用

3.1 对发育与生殖相关基因的研究

    由于受到不同基因组的调控，无脊椎动物胚胎发育的各个阶段都会产生分化出不同的器官与组织，该技术能对这些基因进行鉴定与分离。在研究相关基因调控虾的卵子发生过程时，有国外生物学家使用此技术建立了日本囊对虾卵巢的DNA库，发现在核糖体蛋白的精子或卵巢的基因表达量上有着不小的差异[1]。经过分析得出，相对与肝脏、胰腺、睾丸、眼肌，卵巢中的核糖体蛋白含量要大得多。我国研究者陈金平使用抑制性消减杂交(SSH)技术建立了银鲫心跳起始期与尾芽期的特异性质库，筛选这两个阶段的特异性基因，与中科院生物研究中心数据库进行比较，得出心跳起始期绝大部分为已知基因，而232个尾芽期的杂交克隆中有155个可能是未知基因。这在很大程度上为分子生物学的分机机理研究做出了贡献。

3.2 差异表达基因的筛选

    在水产动物的养殖中，其环境往往受到溶解氧、盐度与水温的影响。美国生物学家Mercury等对太平洋牡蛎进行试验，研究在缺氧的条件下太平洋牡蛎的反应；日本生物学家福川对使用抑制性消减杂交(SSH)技术对草虾基因表达情况的影响进行研究，这种技术在低渗、低氧和高温的情况下研究草虾血细胞内转座子和免疫相关基因的表达情况也被广泛应用[2]。

    此外，还可通过抑制性消减杂交(SSH)文库的建立，对水产动物在污染水环境状况下机能的适应程度进行实验分析，从而有利于基因差异表达的发现及筛选出相应基因。瑞典科学家Manse在2009年研究了后期扇贝幼虫遭到铜离子的胁迫后的基因差异表达，发现了89个cDNA，其中57个可能为未知功能，32个为已知功能[3]。

四、结论

    抑制性消减杂交(SSH)技术是一种鉴定、分离、筛选组织细胞中未知基因表达的新技术，是在抑制性PCR的基础上，结合消减杂交步骤与均等化检验子DNA单链步骤，简单快捷地分离差异基因的方法。

    抑制性消减杂交(SSH)技术能对无脊椎动物胚胎发育的各个阶段中产生分化出的不同的器官与组织的基因进行分离与鉴定。同时，这种技术对水产动物养殖环境在受到溶解氧、盐度与水温的胁迫时，也能筛选出水产养殖生物差异表达的生理功能相关基因。此外，水产动物在水污染环境下的生理功能适应程度也可以对比抑制性消减杂交(SSH)库进行研究，从而筛选出差异表达基因。

【参考文献】

[1]李小庆，景志忠. 抑制性消减杂交技术的应用[J].生物技术通报，2009（05）158—162.

[2]单晓枫，孙佳敏，张洪波等. 抑制性消减杂交技术及其在水生动物基因克隆中的应用[J].吉林农业大学学报，2010（09）：243—249.

[3]杨倩，成军，刘妍等. 抑制性消减杂交技术原理及应用[J].世界华人消化杂志，2008（11）：376—280.