海藻酸钠-琼脂-蒙脱土固定化菌对造纸废水降酚性能的研究

实验使用的苯酚降解菌株为革兰氏阴性短粗杆菌Klebsiella pneumoniae ZS01，来自于本实验室（-80℃超低温冷冻储存冰箱）。

（1）菌株在pH值为7的MPYE培养基中进行富集，每升培养基中含有3 g鱼粉蛋白胨，3 g酵母膏，1 g CaCl₂·2H₂O，1.6 g MgCl₂，在恒温摇床中以150 r/min的转速在35℃下进行培养。菌株生长24 h后，在4℃下以 8000 r/min 的转速离心5 min去除上清液来收集细菌。用无菌水通过紫外可见分光光度计在600 nm下将细菌浓度调整到0.8，用于细菌固定化。

（2）在苯酚降解过程中，富集菌株在35℃的MedA培养基中生长，每升培养基中含有：2 mL质量分数2%天冬氨酸、20 mL pH值为6.8的Solution C溶液（10 g氮川三乙酸，3.33 g CaCl₂，29.5 g MgSO₄·7H₂O，93 mg (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O，99 mg FeSO₄·7H₂O，50 mL微量元素溶液）、1.25 g L-谷氨酸、10 mL质量分数10% NaCl。培养基用1 mol /L KOH和1 mol /L HCl溶液将其pH值调至7.0~7.3后120℃高温灭菌30 min，然后用微孔滤膜加入10 mL维生素溶液、20 mL磷酸盐缓冲溶液（将KH₂PO₄溶液加入到K₂HPO₄溶液中至pH值为6.8）。

（3）苯酚原液的配制：取一定量的苯酚将其配制成6 g/100 mL的苯酚原液并置于4℃冰箱中保存备用。

蒙脱土（240 m²/g）、海藻酸钠、琼脂和苯酚试剂均购自上海阿拉丁生化科技有限公司；其他化学品均为分析纯或色谱纯；所有培养基和实验材料均预先在120℃下高压灭菌。

将蒙脱土和琼脂溶解在去离子水中，混合分散加热至100℃后，加入海藻酸钠，不断加热搅拌30 min，至水凝胶混合均匀，并且确保水凝胶不含气泡。混合均匀的水凝胶溶液在121℃的高压灭菌锅中灭菌30 min，将富集菌株加入至灭菌后冷却的水凝胶溶液（约40℃）中并充分混合均匀。通过注射器将均质水凝胶溶液滴入灭菌的CaCl₂（4% 质量/体积）中，制备直径约3 mm、质量约50 mg的水凝胶珠，于4℃冰箱中固定化12 h。固定的水凝胶珠用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（pH值=7.2）至少洗涤3次以去除微球上残留的钙离子，制得海藻酸钠-蒙脱土-琼脂固定化微球。制备的固定化微球储存在4℃中以备后用。

为更好地研究固定化微球的降解效果，首先探究了影响固定化微球生物降解苯酚性能的4个因素。根据前期预实验结果，在进行单因素实验时，对不同影响因素采用一定递增比例的浓度进行批量实验。将不同浓度的固定化微球和灭菌苯酚加入装有100 mL灭菌MedA培养基的250 mL锥形瓶中，使苯酚浓度达到1000 mg/L。将所有烧瓶用灭菌封口膜密封以防止苯酚氧化，然后置于35℃、150 r/min的恒温培养箱中降解。定期收集样品，并测量残留苯酚浓度。

在上述最佳条件下，还研究了固定化微球在苯酚作为唯一碳源时，苯酚降解性能最优时的苯酚初始浓度。在不同苯酚初始浓度（200、400、600、800、1000 mg/L）条件下，接种相同浓度的游离细菌作为对比实验，将它们与固定化微球的降酚性能进行比较。定期收集样品测量苯酚的残留浓度。苯酚降解数据用于计算苯酚降解的比降解速率和降解动力学分析。

图1(a)为海藻酸钠微球的表面直观图，由图1(a)可以看出，海藻酸钠具有很好的成球性，呈透明白色状。图1(b)为固定化微球的表面直观图，复合琼脂和蒙脱土后，微球变为不透明乳白色，形状规则，球体大小均匀。图1(c)为固定化微球重复使用5次后的外观图，经5次循环后，微球外观已变成黄色，这是因为微球内部繁殖生长出大量的细菌细胞，且实验室细菌为黄色，因此固定化微球也变成黄色。

图1  不同材料的形态

Fig. 1  Appearance of different materials

图2(a)~图2(d)为游离细菌、不同固定材料及固定化微球的横截面形貌图。由图2(a)可以看出，海藻酸钠微球内部包含不规则的交联网络结构，结构类似于先前研究得出的结论^[15]。由图2(b)可以看出，此时海藻酸钠-琼脂-蒙脱土微球内部变成了更为紧凑的片状网络结构。可见琼脂和蒙脱土与海藻酸钠交联后，微球内部孔隙增多，一方面为细菌的附着和固定提供了更大的比表面积，另一方面也增加了底物的传质效率，也有利于营养物质的传输和新陈代谢产物的排出。对比游离细菌（图2(c)）的形貌图，说明固定化微球（图2(d)）内部有大量细菌成功附着。

  

  

  

  

图2 不同固定材料及其固定化微球的ESEM图

Fig. 2 ESEM images of different immobilized materials and immobilized microphere

本研究将海藻酸钠滴入质量分数4% CaCl₂溶液中形成凝胶微球，研究了不同海藻酸钠质量分数对苯酚降解的影响。图3(a)为海藻酸钠质量分数对苯酚降解速率的影响。由图3(a)可知，海藻酸钠质量分数为1%的固定化微球苯酚达到最大降解速率（18.18 mg/（L·h））。随着海藻酸钠质量分数的增加，交联网络结构增多，固定化微球内部比表面积增大，为微生物提供了足够的吸附、生长、繁殖的空间，从而提高了微生物传质效率。海藻酸钠质量分数增加至1.5%时，导致固定化微球的苯酚降解速率下降（15.87 mg/（L·h）），说明高质量分数海藻酸钠会使固定化微球内部过饱和，阻碍底物分子通过微球内部扩散，降低细菌对苯酚的降解速率^[16]。综上，制备固定化微球海藻酸钠的最佳质量分数为1.0%。

  

  

  

  

图3 影响苯酚降解速率的因素

Fig. 3 Factors affecting the degradation rate of phenol

不同蒙脱土质量分数对苯酚降解的影响结果见图3(b)。由图3(b)可知，当蒙脱土质量分数从0增加到1.0%时，苯酚降解速率缓慢增加。当蒙脱土质量分数为1.5%时，苯酚降解速率达最大值17.85 mg/（L·h）。这是因为蒙脱土可以吸收少量苯酚，减轻苯酚对细胞的毒性，为细菌生存创造良好的微环境。在固定化微球中加入蒙脱土可以提高其机械强度、渗透性^[15]。但当蒙脱土质量分数增加至2.0%时，苯酚降解速率与低质量分数蒙脱土苯酚降解速率相当，约（16 mg/（L·h）），这可能是由于固定化微球中高质量分数的蒙脱土堵塞了微球的内部孔隙，阻碍了细菌的生长和底物的扩散，从而抑制了降解细菌的活性。综合考虑，固定化微球中蒙脱土的最佳质量分数为1.5%。

琼脂质量分数对固定化微球降解苯酚性能的影响如图3(c)所示。由于琼脂质量分数增高（0.5%、1.0%），固定化微球的片状网络结构增加，固定化微球内部平均孔径增加，机械强度和稳定性也随之增加，固定化细菌的数量也随之增加，细菌降解苯酚的速率进一步提高，这一结果在Rehman等人^[17]的研究中也有体现。当琼脂质量分数过高时（2.0%），固定化微球内部变得更为致密，导致内部孔径减小，也影响了底物扩散到固定化微球内部的速度，从而降低了苯酚的降解效率。因此，制备固定化微球的最佳琼脂质量分数为1%。

不同包埋细菌浓度（体积分数10%~30%）(OD₆₀₀为0.8)对苯酚降解速率的影响结果如图3(d)所示。由图3(d)可知，随着细菌接种量的增加，苯酚的降解速率逐渐增加。细菌接种量从20%增加至25%时，苯酚降解速率迅速增加到18 mg/（L·h），这是因为细菌细胞对高浓度苯酚的适应性逐渐增强，导致细菌细胞增殖更快，生物降解效率更高。当接种量升高至30%时，降解速率并未显著提高，大量细菌在微球内部迅速繁殖导致微球过饱和，此时不仅影响微球的机械稳定性，也会导致细菌从微球泄露到溶液中，影响后续循环降解实验^[18]。综合上述因素，制备固定化微球的最佳细菌接种量为25%。

根据单因素实验结果，采用正交实验考察影响固定化微球各因素之间的交互作用，从而确定最优的细菌固定化条件，正交因素水平如表1所示。

K_i值表示该列因素水平为i时所对应的实验结果总和，可以判断某个因素的最优水平和最优组合；R值表示某个因素水平的极差，反应某个因素水平波动时，实验结果的变动幅度，R值越大，该因素对实验结果的影响越大，可以判断因素的主次顺序。以固定化微球对苯酚的降解速率为考察指标，正交实验结果如表2所示。由表2可知，影响固定化微球对苯酚降解速率因素的主次顺序为：海藻酸钠质量分数＞细菌接种量＞琼脂质量分数＞蒙脱土质量分数。正交实验得出制备固定化微球的最优组合为：海藻酸钠质量分数1.0%，蒙脱土质量分数1.5%，琼脂质量分数1.0%，细菌接种量25%。在最优固定化条件下制备固定化微球，固定化微球可在60 h内完全降解1000 mg/L的苯酚，苯酚降解速率为16.67 mg/(L·h)。

重复使用性是固定化微球的一个重要考察指标，循环周期中固定化微球苯酚降解速率和细胞活性见图7。如图7(a)所示，在前6个循环中苯酚降解速率迅速增加，苯酚降解速率从16.67 mg/（L·h）增加到45.45 mg/（L·h），此时固定化微球降酚效率处于稳定期，降解时间维持在22 h。由图7(b)可知，设定初始细菌活性为100%，相对活性以其初始活性的百分比表示，循环周期中固定化微球的相对活性与苯酚降解速率的趋势是一致的，重复培养时细菌分泌大量胞外聚合物，形成了生物膜，为重复苯酚降解提供适当的环境^[19]。后期降解效率略微下降，这可能是因为固定化微球中细菌生物质的最大量，限制了底物转移到微球内部中。实验过程中观察发现，珠粒的形态基本保持完整的形态，直到32次循环结束，珠子结构完全被破坏，循环终止。

图7  循环周期中固定化微球的苯酚降解速率与细菌活性

Fig. 7  Degradation rate and cell viability of immobilized micropheres in the cycle

固定化微球的储存稳定性是其是否能被工业化大规模应用的重要考量因素之一。图8为固定化微球和游离细菌的储存稳定性。如图8所示，随着储存时间的延长，固定化微球保持稳定的苯酚降解率，在4℃下储存30天后依然可以去除99%的苯酚。微球内的细菌保持生理稳定性且微球具有较高的机械强度。相比之下，游离细菌的苯酚降解率在超过15天后急剧下降，甚至在30天后失去活性。以上结果表明固定化微球具有很强的储存稳定性，可以重复使用，在实际应用中具有巨大的潜力。

图8  固定化微球和游离细菌的储存稳定性

Fig. 8  Storage stability of immobilized micropheres and free bacteria