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鱼体新鲜度新型检测方法的研究进展

作者:刘建华 曾倩华 徐霞 丁玉庭来源:《食品与发酵工业》日期:2022-05-14人气:44

鱼类富含大量优质的蛋白质、不饱和脂肪酸、维生素和矿物质,是现代健康饮食的首选产品之一。但是,由于鱼体组织肌肉柔软、蛋白质含量高以及体内微生物作用等原因,鱼体极易发生腐败变质。因此,对鱼体的新鲜度进行快速有效的监控具有重要的研究意义,有利于鲜鱼产品的物流监管,减少不必要的产品浪费。

传统的鱼体新鲜度检测方法主要包括感官评价法、物理评价法、化学评价法和微生物评价法,其检测原理和优缺点如表1所示。然而,传统的鱼体新鲜度检测方法费时、耗力且具有破坏性。近几年来,消费者对于鱼体新鲜度新型检测技术的需求显著增加。目前,尽管已经报道了部分鱼体新鲜度新型检测技术,但是对现存的其他鱼体新鲜度新型检测技术,例如气味指纹技术、新鲜度指示型智能包装技术、蛋白组学分析技术、生物传感器技术和光谱技术尚未进行过大量系统的阐述。本综述对这几种技术的优缺点进行了论述和比较,并概述了当前研究中存在的问题和发展趋势,为鱼体新鲜度评价规范的制定提供一定的理论依据,为拓宽鱼体新鲜度新型检测方法的思路提供更多的理论支撑。

表1 鱼体新鲜度传统检测方法的主要特点与检测方式
Table 1 The main characteristics of traditional detection methods of fish freshness

1 气味指纹技术

气味指纹技术是指通过使用气相色谱、质谱、气体传感器等分析手段与多元的统计方法相结合,分析食品中的各种挥发性芳香化合物[1]。常用于鱼体新鲜度检测的气味指纹技术包括:气相色谱-质谱联用法、电子鼻和电子舌等。

1.1 气相色谱-质谱联用法

气相色谱-质谱联用(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)是一种将色谱和质谱结合的在线检测技术,它具有色谱的高分离能力和质谱的高定性能力,适用于复杂挥发性成分的有效分析[2]。目前,为全面高效地分析鱼体中挥发性成分进而判断鱼体品质,研究者通常将其与其他检测技术联合使用,如朱丹实等[3]利用电子鼻结合顶空固相微萃取和GC-MS技术分析了贮藏于0 ℃下真鲷鱼肉的挥发性风味物质变化情况,该研究共检测出36种挥发性物质,其中右旋柠檬烯、十七烷、姥鲛烷、对二甲苯和萘含量与贮藏时间显著相关,可用作真鲷冷藏期间鲜度的挥发性指示物。相似的是,徐永霞等[4]和李婷婷等[5]采用相同的方法分别对贮藏于4 ℃下的大菱鲆鱼肉和三文鱼片中的挥发性成分进行了鉴定与分析,该研究分别发现,大菱鲆中己醛、庚醛、(E-E)-2,4-庚二烯醛、1-戊烯-3-醇和1-辛烯-3-醇等物质在新鲜鱼肉中的含量明显高于腐败鱼肉,这些物质可以作为表征鱼肉新鲜度的挥发性指示物;三文鱼片新鲜度变化的拐点是第6天、第12天和第15天,此时间挥发性成分变化较大,可进行新鲜度评价。

采用GC-MS技术联合其他检测技术评价鱼体新鲜度是未来的发展趋势,比如气相色谱-嗅闻技术、GC-MS-嗅觉技术等,它可以弥补单一技术对鱼类产品中挥发性物质测定不全面的不足。但是在研究过程中,需要克服渔获物的货架期短、采用多种技术的检测结果复杂等问题,以期全面、快速且无损地获得更多鱼体新鲜度的挥发性指示物,实现鱼体的鲜度鉴别和货架期预测与差异评价。

1.2 电子鼻

电子鼻通过气体传感器对被测气体具有不同的灵敏度,实现对鱼体新鲜度评估,这些被测气体主要是微生物生长和生化反应产生的挥发性化合物(如醛、酮、酯、硫和氨化合物)[6]。电子鼻具有高效性、可靠性和易操作性,已应用于罗非鱼、三文鱼、带鱼等鱼类的新鲜度检测[7-8]。但是,由于传感问题和模式识别问题,电子鼻很少被商业化。例如,金属氧化物型电子鼻对湿度敏感,需要在高温条件下工作,不能区分非常相似的化合物。此外,电子鼻系统需要强大的交叉反应传感和指纹模式识别。因此,GUO等[9]将交叉反应比色条形码与深度卷积神经网络(deep convolutional neural networks, DCNN)相结合,构建了一个同时提供气味指纹和智能指纹识别的电子鼻系统,利用智能手机APP界面快速、实时无损监测肉类新鲜度,总准确率达98.5%(图1),有望应用于鱼类新鲜度检测。

目前,如何使电子鼻商业化仍有待进一步深入研究,想要解决这个问题可以尝试构建一个具有交叉反应传感器阵列和数据分析方法的电子鼻系统,完成从非线性数据集中提取信息并准确预测指纹模式的目标。

图1 交叉反应比色条形码组合学和深度卷积神经网络组合形成用于监测肉新鲜度的系统[9]
Fig.1 Working principle of the human olfactory system and our system based on colorimetric barcode combinatorics and DCNN[9]

1.3 电子舌

电子舌是根据模仿人体味觉机理研制而成,由传感器阵列、信号采集系统和模式识别系统3部分组成[10]。评估鱼体新鲜度时,大多数研究者将其气味或味道作为考虑的唯一属性。其中,郑舒文等[11]使用电子鼻和电子舌技术分别检测了鳕鱼的新鲜度,结果表明,电子舌相比于电子鼻能够更加明显地区分鳕鱼的新鲜度等级。事实上,在鱼体新鲜度评价过程中,气味和味道特征同等重要。因此,考虑将电子鼻技术和电子舌技术联合应用于鱼体的新鲜度检测是未来研究趋势。例如,SHI等[12]证明了利用电子鼻和电子舌综合评价贮藏于不同温度下罗非鱼片的新鲜度具有可行性和优越性,并通过建立主成分分析和径向基函数神经网络预测贮藏于0~10 ℃下罗非鱼片的新鲜度。

电子舌技术具有高灵敏度、无损检测、食品感官和安全指标检测限低等优势,正成为鱼体传统检测方法中一种很有前途的补充技术。但是,它经常受到环境因素影响,例如温度会导致传感器漂移等。并且,电子舌技术对检测对象具有局限性,譬如相比于鱼肉等固体样品,其更适用于液体食品的新鲜度监测。目前的研究重点是突破电子舌技术在检测方面的瓶颈,因此将电子舌技术与其他数据处理方法联合使用可以弥补电子舌技术的不足,比如考虑将电子舌技术与神经网络算法结合、或将其与线性和非线性多变量算法结合等,从多个角度更加全面、详细评价鱼体新鲜度变化。

2 生物传感器技术

生物传感器主要包括负责检测生物成分的生物识别元件和将特定生化信息转换为电、热或光信号的物理或化学传感器,其特异性主要基于生物结合反应[13]。目前,应用于检测鱼体新鲜度的生物传感器包括:酶传感器和微生物传感器。

2.1 酶传感器

在酶传感器中,电极上的固定化酶可以与目标材料发生反应产生电活性物质。电极将电活性物质转化为电信号,通过得到的标准曲线计算出目标浓度[14]。目前,检测鱼体新鲜度的酶传感器通常使用黄嘌呤氧化酶作为酶识别元件。比如,MUSTAFA等[15]开发了一种利用黄嘌呤氧化酶(xanthione oxidase,XOD)使次黄嘌呤(hypoxanthine,HX)发生酶转化,测量HX的酶传感器(图2),其测量水平可与商用HX检测试剂盒相媲美。它是一种新型的鱼体新鲜度实时检测方式,在检测过程中不需要添加外源试剂或使用复杂的实验室设备。最近,ZHU等[16]采用激光直写技术,在聚酰亚胺上制备了三维多孔石墨烯柔性纳米酶电极,该电极对黄嘌呤(0.3~179.9 μmol/L)和HX(0.3~159.9 μmol/L)具有酶类动力学特征,检出限分别为0.26 μmol/L和0.18 μmol/L。通过对XT和HX同时检测,并结合人工神经网络算法建立机器学习模型,实现对鱼体新鲜度的智能分析和数字输出。

酶传感器具有成本低、准确度高、精密度好、灵敏度高和选择性好等优点。但是,它会出现电极表面缺乏再现性、工作电极表面钝化等问题。在今后研究中,酶传感器的传感材料改进和电极选择是亟待解决的问题,比如考虑如何将纳米材料、纳米材料与高分子材料的复合以及碳基纳米材料等应用于酶传感器。此外,促进其向微型化和智能化方向发展,也是酶传感器的发展趋势。

图2 XOD生物传感器概念设计和操作[15]
Fig.2 The conceptual design and operation of the XOD biosensor[15]

2.2 微生物传感器

微生物传感器由固定化微生物与电化学装置组成[17],根据微生物的呼吸或代谢作用产生电流、电压、电导的变化进行测定。HOSHI等[18]构建了由固定在膜内的腐败交替单胞菌、流动池、氧电极、蠕动泵、缓冲罐、恒温控制浴和记录器组成的微生物传感器系统。通过检测蓝鳍金枪鱼肉表面的化学成分和传感器电流衰减率来评价鱼肉鲜度品质,一次检测时间只需13 min。

微生物传感器系统利用引起新鲜度变化的整体化学和酶反应,能够快速、准确评价鱼体新鲜度。此外,微生物传感器应用于确定鱼肉口味和肉类老化方面需要大量的研究工作,其发展受限于生物识别元件(微生物细胞),这一难题也值得研究者深入探讨。

3 光谱技术

光谱技术利用物质的吸收光谱、发射光谱或散射光谱特征来研究物质结构和化学组成,在检测鱼类的病原菌、外来污染、蛋白质结构变化、脂质氧化和腐败监测等方面也展现出巨大的潜力[19]。

3.1 可见/近红外光谱技术

可见/近红外光辐射可用于测定鱼体的有机官能团的吸收强度[20],与传统检测方法相比,可见/近红外光谱技术适用范围广、样品量使用少、对环境友好和可重复使用。但是,不同贮藏条件的样品需要不同的模型,常需要校准。

REIS等[21]使用可见/近红外光谱技术结合偏最小二乘判别分析(partial least squares discrimination analysis,PLS-DA)区分新鲜和冻融金枪鱼片,实验表明新鲜样品和冻融样品被正确检测的概率分别为92%和82%。但是,在偏最小二乘回归法建模之前,为消除散射和失真等噪声,需要对频谱进行预处理。为了解决上述问题,WU等[22]采用可见/近红外光谱技术和双层叠加去噪自编码神经网络算法对低温箱中三文鱼鱼肉和鱼皮的新鲜度进行测定。结果表明,此方法不需要预处理,在降低噪声和优化初始权值方面具有更好效果,并且准确性较高(R2=0.98,RMSEP=0.93 d)。因此,将可见/近红外光谱技术与化学计量学方法以及机器学习方法相结合,建立适合不同条件下鱼样品的分析模型,为光谱技术应用于鱼体新鲜度检测提供多种新的可能性。

3.2 高光谱成像技术

高光谱成像技术(hysperspectral image,HSI)将计算机视觉和可见/近红外光谱技术结合,得到同时具有光谱和空间信息的三维数据集[23]。其中,张文娣等[24]和章海亮等[25]采用HSI技术分别对不同解冻方式下的大口黑鲈鱼和多宝鱼的新鲜度进行检测,并准确检测出不同冻融次数和冷冻时间。然而,利用HSI技术对新鲜鱼、冷藏鱼和冻融鱼的贮藏时间同时进行预测和可视化的研究还很少。最近,CHEN等[26]利用HSI技术了实现了珍珠龙胆石斑鱼在不同贮藏条件下贮藏时间的快速准确预测和分布可视化。采用PLS-DA和竞争自适应重加权-偏最小二乘判别分析(competitive adaptive reweighted sampling-partial least squares-discrimination analysis, CARS-PLS-DA)对新鲜鱼、冷藏鱼和冻融鱼进行分类(图3)。结果表明,PLS-DA分类结果总体较好,新鲜、冷藏和冷冻样品的准确率分别为100%、96.43%和96.43%。

HSI是一种快速、无损、可靠的新鲜度在线评估工具,并且可以检测鱼肉变质的变化模式。HSI与化学计量学联用对鱼体新鲜度检测是目前主要的发展趋势,例如考虑将深度学习算法与HSI联合使用是一个可研究方向。

图3 数据处理流程图[26]
Fig.3 Workflow chart for data processing[26]

3.3 荧光光谱技术

样品中荧光化合物被短波长的光激发后,把能量储存起来,缓慢发射出较长波长的光,这种光称为荧光,荧光光谱技术将荧光强度作为发射波长的函数来测量[27]。荧光光谱技术对鱼类等食品可进行快速、非接触和非破坏性分析,测量的浓度是正常吸收光谱的千分之一。其中,前表面荧光光谱(front-face fluorescence spectroscopy,FFFS)技术以特定的入射角度照射鱼类样品,获得包含理化和质构信息的荧光光谱,完成对鱼体新鲜度的检测[28]。如KAROUI等[29]采用前表面荧光光谱技术结合因子判别分析模型成功鉴别了新鲜鲈鱼和冻融鲈鱼,正确率达92%。HASSOUN等[30]采用前表面荧光光谱技术结合物理化学方法评估鳕鱼在不同条件下贮藏12 d的鲜度变化,正确率可达90.5%,结果发现色氨酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的荧光强度与硫代巴比妥酸反应物呈良好的相关性。

FFFS技术具有快速采集数据和替代昂贵、耗时的检测技术的能力,以及可同时确定多个参数的潜力。随着化学计量学工具的广泛应用,FFFS技术在评价鱼类新鲜度方面的潜力不断增加,未来可尝试应用于大量样本以及多脂鱼类等。

3.4 拉曼光谱技术

拉曼光谱技术以拉曼散射效应为基础,不仅能够检测完整细胞和组织内生化分子的浓度、结构和相互作用,而且可以检测鱼体肌肉中的蛋白质和脂质并获得基团的强度和位置变化[31]。拉曼光谱技术检测鱼体新鲜度具有无损检测、样品使用量少、和不需要前处理等特点。但是检测过程中,拉曼散射的微弱影响、生物荧光背景信号的强干扰以及激光产生的一些热量,可能会影响评估的有效性。同时,它不适合发射强荧光的材料,并且由于强可见激光照射,不稳定的化合物通常会遇到光分解和光异构化。目前,拉曼光谱技术结合化学计量学方法已应用于鱼类的质量评估。比如,VELIOGLU等[32]利用拉曼光谱结合主成分分析,成功地对来自6种冻融鱼(竹荚鱼、欧洲鳀鱼、红鲻鱼、蓝鱼、大西洋鲑鱼和飞鱼)进行了物种鉴别及新鲜度分析。在今后研究中,尝试将拉曼光谱与化学计量学方法联合应用于其他鱼种,是鱼体新鲜度新型检测技术发展的一个前进方向。

4 新鲜度指示型智能包装技术

新鲜度指示型智能包装由一个传感元件组成,该元件与食物代谢物相互作用,并在食品品质变化时显示出明显的颜色变化[33]。在各种传感元件中,pH染料是智能包装中最常用的一种。在贮存过程中,腐烂的鱼产生挥发性胺会改变包装内环境的pH值,导致pH染料的颜色发生变化,工作原理如图4所示[34]。近年来,应用于检测鱼体新鲜度的指示型智能包装以其智能化、实时监控鱼体新鲜度的功能而备受关注,但是未对其进行过系统的阐述。表2总结了近几年新鲜度指示型智能包装应用于检测鱼体新鲜度实例。

图4 新鲜度指示膜颜色变化示意图
(以姜黄素为例)[34]
Fig.4 Schematic of the changes in the freshness indicator intelligent food packaging films′color[34]

表2 新鲜度指示型智能包装应用于检测鱼体新鲜度实例
Table 2 Examples of smart packaging for fish freshness detection

4.1 化学合成指示剂型

用于监测鱼类新鲜度的化学合成指示剂具有对酸碱度变化敏感、价格低廉、化学性质稳定、毒性低、可工业化生产等优点。最初,应用于检测鱼体新鲜度的指示型智能包装大多数使用化学合成指示剂。如WANG等[43]使用聚苯胺薄膜作为食品包装比色标签,检测罗非鱼的新鲜度(图5)。研究表明,聚苯胺的颜色变化与挥发性盐基氮有很好的相关性。这类比色标签生产量大、成本低、可再生,并且无需额外的技术支持(如射频识别)即可使用。但是,聚苯胺检测的灵敏度影响了其显色效果。因此,LIU等[35]利用聚苯胺和四苯乙烯研制了1种高灵敏度比色荧光双模式传感标签。当鱼体发生腐败变质时,传感标签不仅显示出从翡翠绿变为孔雀蓝,而且在紫外线照射下,荧光信号从黑色变为亮蓝色。此标签在室温下和冷藏温度下的灵敏度分别是普通传感标签的2.5倍和3.4倍。但是在应用过程中发现,这类指示剂的灵敏性和精确度仍有待提高,并且存在安全隐患。

图5 罗非鱼挥发性盐基氮变化及聚苯胺薄膜的颜色
变化(4 ℃)[43]
Fig.5 TVB-N changes and colour changes of doped polyaniline films sealed in tilapia samples(4 ℃)[42]

4.2 天然色素指示剂型

近年来,研究者已经认识到化学合成指示剂的潜在毒性和危害,研究重点开始转移到天然的酸碱度传感染料上,它们具有无毒、可生物降解和响应性强等优点。最近,EZATI等[44]将天然萘醌色素紫草素吸附在纤维素纸上,制备了1种新型智能pH响应型颜色指示剂,用于监测鱼肉在室温下的新鲜度,结果表明指示剂的颜色变化与样品的新鲜度变化有很高的相关性。此外,该指示剂在贮存4个月后显示出高稳定性。ZHAI等[45]采用溶剂蒸发法将淀粉/聚乙烯醇(starch/polyvinyl alcohol, SPVA)与玫瑰花青素(roselle anthocyanins, RACNs)不同比例结合,制备酸碱度传感膜用于监测冷藏期间鲢鱼的新鲜度。结果表明,不同比例组成的比色膜呈现出不同变色效果,在冷藏温度和室温下稳定长达14 d,相对颜色变化小于5%(图6)。类似的是,ZENG等[38]以明胶/聚乙烯醇为基质,加入从桑椹中提取的花青素,制备鱼体新鲜度比色指示膜。在检测过程中,该膜由鲜红色变为深绿色,明显反映了鱼类在贮藏过程中的新鲜度和腐败程度。

天然色素指示剂为检测鱼的新鲜度变化提供了一种简单而直观的方法,不仅对人体健康无损,而且也有助于降低成本和保护环境。但是,目前发现可用作指示剂的天然色素较少,如何从天然水果和蔬菜中提取色素用作指示剂仍需进一步深入地探索。

图6 比色膜颜色变化[45]
Fig.6 The color changes of the colorimetric films[45]

5 蛋白组学分析技术

鱼死后,内源酶催化蛋白质发生水解反应,过程中产生了促进细菌增殖的营养物质,因此从鱼体肌肉蛋白质的降解、聚合和变性角度分析可能是评价鱼体新鲜度的一个重要途径[46]。目前越来越多的学者开始利用蛋白组学分析技术,对鱼体品质进行检测,并对其变化机理进行详细的解释说明。蛋白组学技术以传统的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳为基础,更多研究者在此基础上加入了等电点分离和质谱技术,即二维电泳-质谱联用技术,目的是了解与研究鱼体肌肉中的蛋白信息。如LI等[47]采用二维电泳-质谱联用技术从4 ℃下贮藏18 d的大菱鲆肌肉中筛选并确定出7种蛋白,这些蛋白可作为大菱鲆的新鲜度变化标记物。相似的是,ETHUIN等[48]采用相同技术区分新鲜和冻融海鲈鱼,发现小清蛋白亚型可能是区分新鲜鲈鱼和冻融鲈鱼鱼片的蛋白质标记物。目前,采用二维电泳-质谱联用技术从分子水平揭示鱼体新鲜度变化显示出相当大的潜力。但是,二维电泳-质谱联用技术在蛋白质鉴定中也存在部分缺陷,例如太大或太小的蛋白质、极度疏水和低丰度的蛋白质很难识别。

近几年,多肽体外标记技术在研究鱼体中不同差异蛋白方面具有突出优势。其中,马聪聪等[49]利用定量蛋白组学技术分析贮藏于0 ℃下不同贮藏时间的三文鱼肌肉蛋白,筛选出28个可能与三文鱼贮存期间鲜度品质变化相关的差异蛋白,并利用多反应检测模式对这些蛋白进行了验证,为揭示不同贮藏时间下三文鱼新鲜度变化机理提供一定理论支撑。ZHANG等[50]采用TMT(tandem mass tag)技术研究了冷藏期间石斑鱼鱼片的蛋白质变化。研究发现,在第0 d、6 d和12 d共有64个显著性差异表达的蛋白,并找到与石斑鱼鱼片的pH值、离心损失、颜色(L*、a*、b*)和质地(硬度、咀嚼性和胶质)变化密切相关的蛋白质。为研究石斑鱼鱼片在冷藏过程中蛋白质的变化及新鲜度下降的机理奠定一定基础。

目前,使用新型蛋白质标记定量技术评价鱼体的新鲜度研究还较少,未来有待进一步深入探索。与基础的二维电泳技术相比,新型蛋白质标记定量技术提高了多个样品检测的准确性,降低了实验误差,克服了二维电泳测定的缺点。蛋白组学技术的不断突破为开发鱼体新鲜度新型检测技术提供了新的契机,为从新鲜度机理层面研究新鲜度变化、实现渔获物冷链物流过程中新鲜度变化的实时监测奠定理论基础。

6 总结与展望

综上所述,现存的新型鱼体新鲜度检测技术具有无损、全面和快速等优势,但是鱼体的腐败变质受多种因素影响,仅凭单一的技术无法精确评价各个时期鱼体的新鲜度。在实际操作中,从鱼体的视觉、嗅觉和味觉多个传感角度全面评价鱼体的新鲜度更加符合未来的研究趋势。近年来,通过将气味指纹技术与智能技术、光谱技术与化学计量学以及蛋白组学与质谱技术等联用的方法,全面、精确地评价鱼体的新鲜度的相关研究仍处于发展阶段,如何使其真正应用于市场有待进一步深入研究。另一方面,对鱼体新鲜度的检测大多停留在宏观水平,而最新研究表明,对蛋白结构的研究促进了鱼体新鲜度机理不断发展,如何从宏观和分子水平上共同探究鱼体新鲜度变化,实现多种新型检测技术与传统技术相结合,得到多指标融合的检测结果也是需要重点考虑的问题。

在未来的研究中,为进一步拓宽新技术的广度和深度,可从以下几个方面开展研究:(1)气味指纹技术与智能技术联用时,建立适合不同条件下鱼样品的气味指纹图谱库,探索并使用智能技术处理气味信号,改善数据处理的局限性,达到对新鲜度检测和控制的目的,推动其向更精准化的方向发展;(2)生物传感器技术需要提高测量精确性和灵敏性,减少前处理时间,并完成可重复性,根据不同处理条件和品种建立相应的数学模型进而判断新鲜度,尝试添加与配备具有彩色阅读软件的智能便携设备,开发多传感器多指标融合检测技术,促进其向取代化学检测方法方面发展;(3)对于光谱技术,进一步开发与优化算法和化学计量学,尝试将其与气味指纹技术等联用,同时降低设备成本、促进设备智能化和微型化,建立完善的光谱检测模型库,扩大该技术在鱼体新鲜度在线检测中的推广应用;(4)对于新鲜度指示型智能包装技术,开发高灵敏、低成本的天然指示剂,将纳米复合材料应用于指示剂膜的制备以提高其抗菌性和抗氧化能力,尝试多指示剂组合形式监测鱼体腐败变质情况,提高消费者认可度,使其逐步走出实验室,真正应用于市场;(5)蛋白组学技术不仅可与代谢组学等其他组学技术联用,同时结合生物信息学,确定更多的鱼体新鲜度变化标记物和标志代谢物,而且可与质谱技术联用以开发新型蛋白质标记定量技术,从鱼体的蛋白结构方面研究新鲜度机理,为研发鱼体新鲜度变化试剂盒和蛋白质变性的控制技术提供更多的可能性。


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