基于碳、氮同位素和矿物元素的青萝卜产地判别

萝卜一词最早在中国古代专著《尔雅》被提及，称其为“芦菔”。青萝卜是十字花科萝卜属一种常见的根茎类蔬菜，种植历史悠久，可生食、做汤、干腌和盐渍等，不仅富含人体所需的营养物质，而且具有一定药用价值[1-3]。但是，由于不同地理来源的青萝卜维生素C含量、外形、口感等存在差异，例如天津的沙窝萝卜通常以水果萝卜出名[4]，消化功能显著，而山东潍坊的浮桥萝卜钙含量丰富。这类特色农产品因其特殊的文化和自然因素、较高的口碑和经济价值，易遭遇掺假和假冒。因此，研究建立精准的青萝卜产地溯源技术体系，对判别青萝卜真实来源、维护消费者权益、规范市场秩序尤为重要。

目前在农产品地理溯源方面常用到的产地判别技术包括矿物元素分析技术、稳定同位素质谱技术、近红外光谱技术及电子鼻技术等[5-7]。生物在生长的过程中受气候、海拔和土壤性质等环境因素的影响，不同产地的农产品体内稳定同位素比值和矿物元素含量呈现出独特性和差异性，具有明显的地域特征[8-9]，因此，矿物元素分析技术、稳定同位素质谱技术在农产品产地溯源中具备较高的应用价值，并且这两项技术具有前处理操作简单、判别模型精准度高等优点，在众多特色地标农产品中被广泛应用[10]。连思雨等[11]和BERTOLDI等[12]通过测定枸杞中的稳定同位素、矿物元素等成分，结合主成分分析(principal components analysis，PCA)、偏最小二程判别分析(partial least squares discrimination analysis，PLS-DA)等化学计量方法建立判别模型，准确率高达95%以上；MA等[13]和王洁[14]基于矿物元素、矿物元素与稳定同位素比率结合等方式对扁形茶、龙井茶的产地溯源技术进行探究，建立高精准度的鉴别模型，进一步肯定这2项技术在产地判别方面的作用；此外，矿物元素分析技术、稳定同位素质谱技术等在谷物[15-17]、果蔬[18-19]以及药材[20-21]、水产品[22-24]等众多领域有着广泛且高效的应用，但在萝卜地理来源的鉴别方面鲜有应用研究。

本研究结合当前产地研究的现状，选取山东、天津、河南3个省份具有地理标志认证的10个品种青萝卜，通过测定稳定同位素比值和矿物元素含量，开展青萝卜地理信息的相关性研究与应用，并结合PLS-DA、线性判别分析(linear discriminant analysis，LDA)等化学计量学方法建立判别模型。旨在服务“三品一标”，为保护青萝卜产品品种、品质、品牌以及提高经济效益提供有效方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

采集地理来源真实可靠的青萝卜样品177份，其中天津57份，河南59份、山东61份，具体信息如表1所示。稳定同位素标准物质USGS43(δ13C=-21.34‰，δ15N=+8.44‰)，美国地质勘探局Reston稳定同位素实验室；元素国家标准物质菠菜GSBW10015，地球物理地球化学勘查研究所；元素标液为电感耦合等离子体分析用多元素标准溶液GNM-M311129-2013，国家有色金属及电子材料分析测试中心逐级稀释配得；浓硝酸(65%)，美国默克制药。

表1 青萝卜样本基本信息
Table 1 The basical information of the green turnip samples

1.2 仪器与设备

Flash 2000元素分析仪、Delta V Advantage稳定同位素比值质谱仪，美国赛默飞世尔公司；NEXION 300X电感耦合等离子体质谱仪，美国珀金埃尔默股份有限公司；破壁机E310，美国Vitamix公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品前处理

青萝卜样品采集后，在实验室用自来水将泥土清洗、阴干后，测定单个重量、长度等基础数据。四分法分取萝卜样品并切块，用破壁机将样品匀浆粉碎，分取100 g匀浆后的样品放入冷冻干燥机进行冷冻干燥(-50 ℃)12 h以上，干燥后样品放入-80 ℃超低温冰箱保存备用。

1.3.2 稳定同位素测定

碳、氮同位素比值的测定：取0.2 mg青萝卜粉末样品于锡杯(5 mm×8 mm)中压实包好后直接放入元素分析仪自动进样器中，在高温下燃烧、还原，最终生成气体，按N2、CO2的顺序先后进入同位素比率质谱仪进行检测。进样序列中每隔10个样品插入一个标物进行质量控制，样品稳定同位素比值应用标物进行单点校正。仪器标准偏差小于0.2‰。

仪器工作参数：氧化管温度为1 150 ℃，还原管温度为850 ℃，通氧时间为70 s，元素分析仪氦气吹扫流量为230 mL/min，进入质谱仪氦载气流量为100 mL/min，高纯N2、CO2(纯度>99.999%)为参考气。

1.3.3 元素测定

用电子天平准确称量0.3 g各产地青萝卜冻干粉末样品于消解罐中，每个样品3个平行。向消解罐中加入10 mL浓硝酸，过夜，第2天不盖盖子在智能石墨消解炉中进行120 ℃石墨消解至澄清，约4 h，冷却至室温后从微波消解仪中取出，用少量去离子水分3次洗涤消解管，合并洗涤液及消解液，并定容至25 mL，进行上机检测。

仪器工作参数：电感耦合等离子体质谱仪(inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS)每次测定前均进行自动调谐，根据仪器的状态对参数进行调整，以满足灵敏度、氧化物、稳定性等各项指标。仪器调谐完毕后，将内标进样管插入1 μg/mL 内标溶液中进行矫正，样品管依次插入各浓度的标准溶液进行制作标曲，最后测定样品。射频功率1 230 W；载气流速1.21 L/min；Babington雾化器，雾化室温度2 ℃；蠕动泵转速0.1 r/s。用内标法进行校正。仪器调谐完毕后，将内标进样管插入1 μg/mL内标溶液中(分析过程中始终进内标溶液)，样品管依次插入各浓度的标准溶液(浓度依次递增)和待测样中进行测定。

1.4 多元统计分析

应用Origin 8.0软件对碳、氮稳定同位素进行箱线图分析，并应用SPSS 25.0进行单因素ANOVA检验，最后分别以所测青萝卜中18种矿物元素为变量，应用SIMCA-P 13.0分析软件进行PLS-DA建模，应用MPP软件结合LDA算法建立青萝卜产地判别模型。

2 结果与分析

2.1 不同产区青萝卜多种矿质元素含量和稳定同位素比值分析

本研究共测定天津、河南、山东3个省份177份青萝卜样品中的碳、氮同位素比值和18种矿物元素的含量。

首先通过箱线图对不同地区的稳定同位素值进行分析，如图1所示。从整体分析，天津、河南、山东3个省份的青萝卜样品中的δ15N值为0.37‰～2.37‰，且均有重合，差异较小，天津和山东两省样本δ15N值范围较广，河南样本的δ15N值范围较为集中；山东、天津、河南3个省份的青萝卜样品δ13C值分布也显示整体差异不显著，范围为-29.68‰～-27.88‰；从不同省份不同地区样品细分发现，天津省的武清、西青两个地区萝卜的δ15N值存在差异，河南省固始县与上蔡县、固始县与郏县间的δ15N值存在差异，山东寿光和潍城、滕州两个地区δ15N值存在差异；但不同地区样品间δ13C值并未存在显著差异。这表示碳、氮同位素在判别不同省份的青萝卜时判别贡献率较低，但δ15N值对进一步精确鉴别小产区青萝卜的地理来源时可能会具有相对显著贡献，这与当地的土壤条件、施肥状况以及农药使用情况有关，可为今后进一步研究青萝卜的产地提供依据。

A-不同省份δ13C值范围；B-不同省份δ15N值范围；C-不同亚地区δ13C值范围；D-不同亚地区δ15N值范围
图1 不同地区青萝卜样品C、N同位素比值分析
Fig.1 Analysis of C and N isotope ratios of green turnip samples from different regions

其次，应用SPSS对所测定的18种矿物元素进行单因素ANOVA检验，由表2可知，天津、河南、山东3个省份的整体元素含量分为3个梯度，Na、Ca、P、Mg 4种元素含量较高，平均含量均超过1 000 mg/kg，且Na、Ca、Mg 3种元素在不同省份间均存在显著差异，天津地区青萝卜样品中Na含量最高，达10 786 mg/kg，河南地区Ca含量最高为6 182.05 mg/kg，山东地区Mg含量最高为2 237.28 mg/kg；Fe、Sr、Zn、B、Ba、Mn、Cu相对较低，但整体元素含量均高于1 mg/kg，Fe、Sr、Zn、B、Mn 5种元素在天津、河南、山东3个省份间均存在明显差异；Mo、Cr、Ni、Se、Cd、As、Co 7种元素含量最低，平均含量小于1 mg/kg，其中只有As在不同省份间差异显著(P<0.05)。

2.2 判别分析

植物中稳定同位素比值和矿物元素含量的差异反映了其生长的环境及气候条件，为进行产地溯源、建立模型提供了依据。由图2分析结果可知，不同地区青萝卜中的碳、氮同位素整体差异范围小，因此，本研究在进行农产品产地溯源时，采用矿物元素含量和

表2 不同地区青萝卜元素含量分析 单位：mg/kg

Table 2 The analysis of element content in green turnip from different areas

注：不同小写字母表差异显著(P<0.05)

化学计量学方法结合的方式建立青萝卜样品的判别模型。目前，在产地溯源的研究中常用到的化学计量学方法主要包括PCA、PLS-DA、支持向量机(support Vector Machine，SVM)、人工神经网络(back propagation-artificial neural network，BP-ANN)以及LDA等。本文对青萝卜样品中的矿物元素含量进行分析，结合PCA-X、PLS-DA、LDA 3种算法建立产地判别模型。

图2 三个产地青萝卜VIP值
Fig.2 The results of VIP in green turnip from different producing areas

2.2.1 PLS-DA

PLS-DA是一种有监督的识别方法，它既可以实现对数据进行降维，同时可以结合回归模型利用一定的判别阈值对回归结果进行判别分析，同时因其所建的模型比较稳定，且具有很强的抗干扰能力，目前建立产地判别模型时被广泛应用。对所有青萝卜样品按照省份进行分组，分为天津、河南和山东3个组别，提取青萝卜样品中5个主成分应用PLS-DA算法结合矿物元素含量进行数据统计，如图2元素VIP贡献值图看出，Cr、Ca、Na、Mg、Ni、Cd共6种元素在青萝卜判别时贡献率较大。其中Ca、Na、Mg 3种元素与2.1中单因素ANOVA检验的判别结果一致。如图3所示，由3个省份二维模型图可以看出，天津样品、河南样品以及山东样品3个省份的青萝卜之间均有不同程度的重合，在判别时，天津仅有2个被误判为山东样品，山东样品仅有1个被误判为天津，不同省份样品未发生明显聚集。因此，基于青萝卜矿物元素含量结合PLS-DA算法建立天津、山东、河南3个省份的青萝卜样品判别模型具有一定的实际应用意义。

图3 萝卜样品PLS-DA归类判别
Fig.3 Classification of green turnip from different producing areas by PLS-DA model

2.2.2 LDA

LDA是一种有监督判别方法，以投影后类内方差最小，类间方差最大的原则对样品数据进行降维，实现样品的分类。应用LDA算法对3个省份的青萝卜样品中18种矿物元素进行统计分析，建立判别模型。结果如图4所示，在进行模型验证时，河南有4个样品被误判为山东样品，在山东样品判别时，分别有3个青萝卜样品被误判为河南，2个青萝卜样品被误判为天津，天津57个青萝卜样品52个均能被准确判别，仅有5个被误判为山东样品。河南样品和天津样品都容易误判为山东，这与箱线图的分析结果相符。由表3可知，应用PLS-DA对青萝卜进行产地判别模型，天津萝卜的预判效果较好，模型验证和交叉训练时模型的判别率为91.23%，但河南和山东样品在模型中识别准确率较低；采用LDA算法建模，3个省份模型的验证集和训练集判别率均在90%以上，表明LDA算法在进行萝卜产地溯源时的判别时的效果明显高于PLS-DA，在模型训练时整体判别率为93.79%，且Ca、Na、Mg元素在建模时依旧显示较大贡献率。

图4 三个产地青萝卜样品LDA归类判别
Fig.4 Classification of green turnip from different producing areas by LDA model

表3 LDA和PLS-DA模型预测准确率 单位：%

Table 3 The accuracy of LDA and SVM models

目前，王游游等[25]对绝明子产地溯源时发现，δ15N值、δ13C值等稳定同位素和矿物元素结合对鉴别决明子产区有更加显著的效果，筛选出具有显著差异的19种矿物元素以及其中重要权重因子，肯定δ15N 值对农产品产地判别时的贡献，并提出矿物元素对产地判别的效果明显优于同位素；杨健等[26]发现，稳定同位素可单独达到鉴别何首乌产地的效果，但稳定同位素结合元素的模型判别率得到进一步提高；本文在分析青萝卜样品中的矿物元素含量以及同位素比值时，同样发现矿物元素对产地判别的效果明显优于稳定同位素，且单独应用矿物元素对天津、山东、河南3个地区的青萝卜样品的判别率均在90%以上。因此，本文建立青萝卜样品的产地判别模型进一步肯定了矿物元素在青萝卜产地鉴别中的实际应用意义，精简进行青萝卜溯源需要测定的变量，这为未来青萝卜产地溯源提供理论依据，具有实际应用意义。

3 结论

本研究通过测定天津、河南、山东3个省份不同地区青萝卜样品中的稳定同位素比值和矿物元素含量，首次为青萝卜建立了产地鉴别模型。研究发现，这3个产地的样品有明显的地域分布特征，箱线图分析、单因素ANOVA检验表明，元素在进行青萝卜产地判别的贡献明显高于碳、氮稳定同位素，18种矿物元素中，Na、Ca、Mg共3种元素在结合不同的化学计量学方法分析时均表现出显著差异性。PLS-DA算法建立判别模型时，对山东和天津的样品识别率较低，对天津样品识别率较高，模型训练整体判别率仅为86.44%；应用LDA算法进行产地鉴别时，模型对天津、河南、山东青萝卜样品的识别率均较高，模型在验证和训练的总体判别率分别为92.09%和93.79%。2种化学计量学方法进行判别分析的结果显示，LDA对不同省份样品的区分效果明显优于PLS-DA算法。本文首次对青萝卜样品的矿物元素和稳定同位素进行分析，并结合化学计量学方法建立的产地判别模型，LDA算法在建模过程中表现良好。根据青萝卜不同产地之间的差异性建模，矿物元素结合LDA算法的效果理想，可为下一步青萝卜产地溯源技术的研究提供新的研究方向和理论依据。