基于气相色谱-质谱/脉冲火焰检测器和主成分分析对不同品种柚汁 挥发性风味组分的分析

柚是一类果型硕大、风味独特的柑橘品种，主要分布在中国、越南、美国和泰国等国。据联合国粮农组织数据统计，我国是全球最大的柚子生产国，2019年产量可达501.31万t，占全球柚类总产量的50%以上。我国柚子品种繁多，主要包括沙田柚群、文旦柚群、种间杂种柚群三类；按照果肉颜色的不同，也可分为白囊型柚和红囊型柚。柚子营养价值丰富，富含葡萄糖、果糖、果胶、蛋白质、维生素、矿物质、呋喃香豆素、黄酮类化合物等组分，具有重要的开发利用价值。目前，我国柚子主要以鲜果销售为主，较少的柚果用于加工成蜜饯、柚子茶及柚汁等产品。随着我国饮料行业快速发展，因独特的风味和口感，柚汁及其饮料产品深受消费者的喜爱。

挥发性组分是柚汁中重要的次生代谢产物，对柚汁的风味具有重要的影响。CHEONG等[1]采用顶空固相微萃取(head space-solid phase micorextraction，HS-SMPE)方法结合气相色谱-质谱/脉冲火焰检测器(gas chromatography-mass spectrometry/pulsed flame photometric detector，GC-MS/PFPD)，对马来西亚主产的PO51(白柚)和PO52(粉红柚)2个不同品种的柚汁中挥发性组分进行了测定，分别检测到49种和65种挥发性组分，且白柚中萜烯类组分数量明显少于粉红柚。葡萄柚汁是一类营养价值丰富、口感独特的果汁产品。BUETTNER等[2]在手榨的葡萄柚汁中共发现25种重要的风味组分，其中具有极低感官阈值(0.000 1 μg/L[3])且呈现葡萄柚风味的1-对孟烯-8-硫醇和感官阈值为0.000 1 μg/L且呈现黑醋栗风味的4-巯基-4-甲基-2-戊酮是最为关键的风味组分[4]。此外，沙田柚果肉中挥发性组分以酯类为主(47.99%～91.69%)，根据产地不同沙田柚果肉中酯类含量不同[5]。

多元数据统计，如主成分分析(principal component analysis，PCA)，被广泛用于从复杂的数据中提取有意义的信息[6]。肖作兵等[7]采用PCA分析7种不同厂家的菊花精油样品中的5种感官属性(花香、木香、草香、果香、酸香)，明确了7种产品与感官属性之间的关系。VIVIAN等[8]采用PCA对柚子不同部位(花、叶、皮和果汁)聚类趋势进行了可视化研究，据PCA载荷图发现，香茅醇和a-松油醇有助于柚皮和柚汁的分离。

目前，关于柚汁风味的研究主要集中在国外盛产的柚品种(葡萄柚、PO51柚、PO52柚等)，针对我国主产的柚子品种，如沙田柚、琯溪蜜柚、梁平柚、胡柚等品种中挥发性组分，还未进行全面和深入的探究。为了明确我国主产柚子品种中挥发性组分分布及风味特性，本研究拟以我国主产的5个不同品种的柚汁为研究对象，利用HS-SPME结合GC-MS/PFPD对柚汁中挥发性组分进行定性和定量分析，采用气味活性值(odor activity value，OAV)筛选特征风味组分和PCA区分柚子品种，该研究为我国柚汁及系列产品生产加工、柚子风味选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验材料

沙田柚，广东梅州；琯溪蜜柚和梁平柚，重庆市梁平区；胡柚和葡萄柚，重庆市北碚区农贸市场。

1.1.2 实验试剂

C5～C20正构烷烃，美国Honeywell公司；环己酮(纯度99%)、甲基乙基硫醚(纯度96%)，上海阿拉丁公司。

1.2 仪器与设备

7890B GC-5977A MS气质联用仪、RTX-wax 色谱柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，美国安捷伦科技有限公司；OI 5380 PFPD脉冲火焰光度检测仪，美国OI公司；H-100-DWBIA0惠人榨汁机，上海韩惠人爱家电科技有限公司；DouR@SPT-H氮空吹扫浓缩仪，北京斯珀特科技有限公司；Milli-Q超纯水系统，德国Merck-Millpore公司；50/30 μm二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷萃取头(DVB/CAR/PDMS)萃取头，美国Supelco公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器，上海力辰科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品制备

将柚子鲜果手动去皮、去白化层和去籽，得到柚子果肉，采用惠人榨汁机压榨出汁，随后装瓶、并置于-20 ℃待用。

1.3.2 挥发性组分的测定

将5 mL鲜榨柚汁置于含有磁子的20 mL顶空瓶中，加入内标环己酮2.5 μL(9.423 mg/mL)和甲基乙基硫醚1.5 μL(8.42 mg/mL)，混匀，采用聚四氟乙烯材质的隔垫密封。将顶空瓶置于40 ℃水浴中平衡20 min，采用2 cm的50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取头插入顶空瓶中，萃取挥发性组分30 min。

GC-MS/PFPD测定条件:采用安捷伦7890B GC-5977A MS/OI5380 PFPD设备对果汁中的挥发性组分进行测定，将备好的萃取头置于GC进样口200 ℃解析5 min，挥发性组分在RTX-wax色谱柱上进行分离后进入MS和PFPD检测器进行测定。柱温设置程序：初始温度为35 ℃，保持6 min，7 ℃/min升至203 ℃，保持10 min。载气为氦气，流速为1.5 mL/min。EI离子源的电子能量为70 eV，传输线温度设置为280 ℃。m/z扫描范围为33～500 mau。PFPD检测器的温度设置为250 ℃，PMT电压为498 V，载气和燃气分别为氦气、空气和氢气。每个样品重复3次。

1.3.3 定性和定量分析

定性分析：通过正构烷烃C5～C20计算挥发性组分的线性保留指数(linear retention index，LRI)，并与已发表文献中的LRI进行匹配，柚汁中的挥发性非硫组分的定性也可通过匹配NIST11、W10 N14库中MS总离子流，挥发性硫组分也通过PFPD进行定性。

定量分析：挥发性非硫组分的定量主要通过内标环己酮进行，而挥发性硫组分的定量主要通过内标甲基乙基硫醚进行。定量计算如公式(1)所示：

C待

(1)

式中：C待，待测的挥发性组分的质量浓度，μg/mL；A待，待测的挥发性组分的峰面积；C，内标浓度；A内标，内标组分在MS或PFPD上的峰面积。

1.3.4 OAV计算

OAV是挥发性组分的浓度与感官阈值的比值，通常当OAV≥1时，表明该风味组分对果汁的整体风味具有贡献。

1.3.5 数据处理

采用SPSS 25.0对数据进行方差分析(analysis of variance，ANOVA)和Duncan多重检验；化学工作站F.01.01.2317对挥发性组分进行定性分析。采用Origin 7.5 绘图和Unscrambler 10.4软件进行PCA分析。

2 结果与分析

2.1 不同品种柚汁中挥发性组分的定性分析

采用HS-SPME对5种不同品种(琯溪蜜柚、梁平柚、葡萄柚、胡柚、沙田柚)柚汁中的挥发性组分进行萃取和浓缩，wax色谱柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)进行分离，并以MS检测器为主，PFPD检测器为辅，对柚汁中挥发性组分进行全面检测。通过匹配挥发性组分的MS总离子流与NIST11、W10 N14库中MS总离子流、计算挥发性组分的LRI并与已发表文献中相应色谱柱上的LRI进行比较以及PFPD硫检测器的信号值，对5种不同品种柚汁中挥发性组分进行准确定性。结果如图1和表1所示，共86种挥发性组分被检测，包括萜烯类包括萜烯类(25种)、醇类(22种)、醛类(11种)、酮类(8种)、酯类(12种)、挥发性硫化物类(volatile sulfur compounds, VSCs)(4种)及其他种类(4种)，其中硫化氢、乙硫醇、二硫化碳、甲硫醚，首次在琯溪蜜柚、梁平柚、胡柚、沙田柚4个品种柚汁中检测到。不同品种柚汁中挥发性组分数量呈现不同，在琯溪蜜柚、梁平柚、葡萄柚、胡柚、沙田柚汁中分别检测到34、39、39、32、32种。不同品种柚汁中挥发性组分种类呈现不同，如图2所示，萜烯类和醛类数量最多的是梁平柚汁(21、8种)，其中β-蒎烯、α-水芹烯、(-)-a-荜澄茄油萜、衣兰烯、(-)-a-蒎烯、马兜铃烯、β-榄香烯、β-石竹烯、香树烯、γ-榄香烯、a-榄香烯、α-葎草烯、巴伦西亚橘烯、γ-杜松烯、δ-杜松烯、a-二去氢菖蒲烯、3-己烯醛、(E)-2-庚烯醛、壬醛、反-2-辛烯醛仅在梁平柚汁中检测到；醇类物质和VSCs在葡萄柚汁中数量最多(16、4种)，其中4-萜烯醇、a-萜品醇、橙花醇和香叶醇仅在葡萄柚汁中检测到；沙田柚汁中酯类物质数量最多(10种)，这与艾沙江·买买提等[5]对不同产地沙田柚果肉挥发性物质的研究结果一致。

图1 采用GC-MS/PFPD对5种不同柚汁中挥发性组分检测色谱图
Fig.1 The chromatography of volatile compounds in 5 different varieties of pomelo juice by GC-MS/PFPD

图2 五种不同柚汁中各类挥发性组分数量
Fig.2 The quantity of volatile compounds in 5 different varieties of pomelo juice

2.2 不同品种柚汁中挥发性组分的定量分析

采用内标环己酮和甲基乙基硫醚对5种不同柚汁中86种挥发性组分进行定量分析，结果如表1所示。挥发性组分的含量在5个品种中分布不同，梁平柚汁中主要挥发性组分是萜烯类(86.47%)和醛类(6.77%)，其中d-柠檬烯[(18 370.30±93.09) μg/L]、β-石竹烯[(6 957.60±64.37) μg/L]、δ-杜松烯[(6 161.17±36.12) μg/L]、α-衣兰油烯[(4 095.96±41.01) μg/L]、γ-杜松烯[(3 923.10±16.76) μg/L]、δ-榄香烯[(1 087.09±11.24) μg/L]、正己醛[(2 317.29±50.92) μg/L]是梁平柚汁中主要的挥发性组分。β-石竹烯具有重要的药用价值，可以选择性的结合CB2受体，对治疗身体炎症、疼痛、动脉硬化和骨质酥松症等症状具有重要作用[9-10]。d-柠檬烯是柑橘汁主要的挥发性组分，已在柚汁[1]、橙汁[11]、宽皮柑桔汁[12]、柠檬汁[13]中报道。d-柠檬烯[(18 906.70±89.57) μg/L]是葡萄柚汁中主要的挥发性组分，这与LIN等[14]研究相一致。1-对孟烯-8-硫醇是葡萄柚汁中特征风味物质，含量极低，易在贮藏的葡萄柚汁中[(0.42±0.047) μg/L]检测到[15]，在本研究中，新鲜的葡萄柚汁中并未检测到1-对孟烯-8-硫醇，这与JABALPURWALA等[15]研究相一致。与其他4种柚汁相比，葡萄柚汁中VSCs质量浓度最高，包括硫化氢[(0.10±0.001 0) μg/L]、甲硫醇[(0.08±0.005 2) μg/L]、二硫化碳[(0.16±0.008 4) μg/L]、甲硫醚[(2.37±0.022) μg/L]，这些VSCs对葡萄柚汁风味的整体呈现具有重要的影响。琯溪蜜柚汁主要挥发性组分为：1-己醇[(9 329.22±113.83) μg/L]、(Z)-3-己烯-1-醇[(7 974.95±74.59) μg/L]、(E)-2-己烯-1-醇[(2 289.62±56.59) μg/L]、正己醛[(1 656.57±65.14) μg/L]和乙醇[(3 600.35±89.91) μg/L]。胡柚汁中醇类(57.79%)和酯类(31.73%)为主要的挥发性组分。与其他4个品种相比，沙田柚汁中富含酯类物质，其中乙酸乙酯[(4 640.67±110.42) μg/L]和3-羟基己酸乙酯[(1 972.46±26.78) μg/L]是沙田柚主要的酯类成分，乙酸甲酯、甲酸丙酯、丙酸乙酯、异丁酸乙酯、丁酸甲酯、2-甲基丁酸乙酯、碳酸二乙酯7种酯类物质仅在沙田柚汁中检测到。此外，5种柚汁中挥发性组分总含量呈现不同，其中梁平柚汁中挥发性组分含量最高，胡柚汁最低。

2.3 不同品种柚汁中挥发性组分的风味活性物质分析

为了筛选5种不同品种柚汁中特征风味物质，明确每种柚汁中特征风味物质对风味呈现的贡献及不同品种之间的风味差异，通过各个风味物质的浓度与感官阈值的比值，计算各个风味物质的OAV值。当OAV值≥1时，表明风味物质对果汁的整体风味具有贡献作用，被认为是果汁的特征风味物质，OAV值的大小也可反映出风味物质的贡献程度[16]。经查文献，明确各个挥发性风味物质的气味属性和气味感官阈值。如表2所示，不同品种柚汁中特征风味呈现不同，琯溪蜜柚、梁平柚、葡萄柚、胡柚、沙田柚汁中特征风味物质(OAV≥1)数量分别为21、16、16、14、18，其中梁平柚汁中萜烯类特征风味物质最多(5个)，葡萄柚汁中醇类特征风味物质最多(6个)，琯溪蜜柚汁中醛类和酮类特征风味物质最多(7个和3个)，沙田柚汁中酯类特征风味物质最多(6个)。具有橘香的庚醛(OAV=65.79)和辛醛(OAV=55.35)，花香的芳樟醇(OAV=33.92)和β-紫罗酮(OAV=24 167.52)，果香的3-羟基己酸乙酯(OAV=19 535.65)、丁酸乙酯(OAV=212.10)和乙酸乙酯(OAV=33.97)，青草味的正己醛(OAV=368.13)和(E)-3-己烯-1-醇(OAV=84.81)，青椒味、油脂味的(E)-2-己烯-1-醇(OAV=34.39)，蘑菇味的1-辛烯-3-醇(OAV=305.01)是琯溪蜜柚汁中重要的特征风味物质；具有橘香的d-柠檬烯(OAV=306.17)，果香的β-月桂烯(OAV=39.68)，青草味的正己醛(OAV=514.95)和1-戊烯-3-酮(OAV=94.13)，油炸味、香料味的β-石竹烯(OAV=108.71)是梁平柚汁中重要的特征风味物质；具有橘香的d-柠檬烯(OAV=315.11)，花香的芳樟醇(OAV=246.93)，果香的β-月桂烯(OAV=35.84)和异丁醇(OAV=31.50)，青草味的(E)-3-己烯-1-醇(OAV=32.00)是葡萄柚重要的特征风味物质；具有橘香的辛醛(OAV=35.17)，果香的异丁醇(OAV=79.67)，青草味的正己醛(OAV=33.30)是胡柚汁中重要的特征风味物质；具有橘香的庚醛(OAV=65.92)和辛醛(OAV=44.05)，果香的异丁酸乙酯(OAV=759.08)、丁酸乙

表1 五种不同柚汁中挥发性组分的定性和定量分析
Table 1 Identification and quantitative analysis of volatile compounds in 5 different varieties of pomelo juice

续表1

续表1

注：a：利用正构烷烃C5～C20计算LRI；b：LRI来自风味数据库https://www.vcf online.nl/VcfCompoundSearch.cfm 和http://www.odour.org.uk/index.htmL；-代表化合物在该品种未被检测到

表2 五种不同柚汁中挥发性组分的OAV值
Table 2 The odor activity values of volatile compounds in 5 different pomelo juice

续表2

注：-代表化合物在该品种未被检测到；a气味感官阈值来自风味数据库https://www.vcf online.nl/VcfCompoundSearch.cfm和http://www.odour.org.uk/index.htmL；乙酸的气味感官阈值介质为空气；3-羟基己酸乙酯的气味感官阈值介质为14%(体积分数)的乙醇/水溶液；其他组分的气味感官阈值介质为水

酯(OAV=967.32)、2-甲基丁酸乙酯(OAV=13 889.24)和3-羟基己酸乙酯(OAV=43 832.55)，青草味的正己醛(OAV=346.79)，油脂味的癸醛(OAV=1 181.60)，橙皮味的2-戊酮(OAV=380.93)是沙田柚汁中重要的特征风味物质。β-月桂烯、d-柠檬烯、(E)-3-己烯-1-醇、(E)-2-己烯-1-醇、乙醛、正己醛、庚醛、(E)-2-己烯醛、甲硫醚是柚汁中的普遍存在的特征风味物质(至少4种柚汁中检测到且OAVs≥1)。VSCs是食品中常见的异味物质，降低柑橘汁风味品质，这种现象已在宽皮柑橘汁[17]、橙汁[11]、葡萄柚汁[15]中发现，加热或贮藏过程加速VSCs的生成[11,18]。

2.4 主成分分析

本研究采用PCA法对5种不同柚汁样品及其挥发性组分进行分析，得到由得分/载荷图组成的双标图(图3)。在PCA模型中，主成分PC1(37.7%)和PC2(31.1%)累计方差贡献为68.8%，能够反映柚汁样本的主要特征。如图3所示，5个品种(琯溪蜜柚、梁平柚、葡萄柚、胡柚、沙田柚)相互之间可以很好地分开，表明不同品种柚汁中挥发性组分种类或浓度之间具有明显差异性。根据主成分在双标图上的距离来反映柚汁中挥发性组分与柚子品种之间的相关性。琯溪蜜柚汁主要与醛类(乙醛、辛醛、庚醛)、醇类[(E)-2-己烯-1-醇、(Z)-3-己烯-1-醇、1-戊烯-3-醇、1-辛烯-3-醇、1-己醇]、酸类(己酸)、酯类(3-羟基己酸乙酯)10种挥发性组分密切相关；梁平柚汁主要VSCs类(硫化氢)和萜烯类(δ-榄香烯、β-月桂烯、β-水芹烯)密切相关；葡萄柚主要与醇类(芳樟醇、1-庚醇)、酮类(2-庚酮、2-戊酮)、萜烯类(对伞花烃)和呋喃类(2-正戊基呋喃)密切相关；胡柚主要与醇类(1-辛醇、1-戊醇、异丁醇)、VSCs(二硫化碳、甲硫醚)、酮类(甲基庚烯酮)和酯类(乙酸乙酯)密切相关；沙田柚汁主要与丁酸乙酯密切相关。

图3 五种不同柚汁中挥发性组分的PCA得分/载荷图
Fig.3 Principal component analysis biplot (score and load values) for volatile compounds in 5 different varieties of pomelo juice

3 结论与讨论

采用GC-MS/PFPD检测技术对5种不同品种柚汁中挥发性组分进行分析，共鉴定出86种挥发性组分，即在琯溪蜜柚、梁平柚、葡萄柚、胡柚、沙田柚汁中分别检测到34、39、39、32、32种挥发性组分，根据果肉颜色不同，红柚类(琯溪蜜柚、葡萄柚、胡柚)中总挥发性组分数量并非全部都高于白柚类(梁平柚、沙田柚)，前期CHEONG等[1]研究仅发现红柚汁PO 52比白柚汁PO 51中的总挥发性组分数量多，因此，柚汁中总挥发性组分的数量与柚子品种密切相关，与柚子果肉颜色无关。各类柚汁中挥发性组分的含量呈现不同，其中琯溪蜜柚汁中挥发性组分含量主要以醇类(78.13%)和醛类(9.32%)为主，梁平柚汁以萜烯类(86.47%)和醛类(6.77%)为主，葡萄柚汁以萜烯类(55.80%)和醇类(39.56%)为主，胡柚汁以醇类(57.79%)和酯类(31.73%)为主，沙田柚汁以醇类(46.65%)和酯类(35.64%)为主。柚汁中检测出4种VSCs(硫化氢、甲硫醇、二硫化碳、甲硫醚)，早期在葡萄柚汁有报道[15]，然而，首次在琯溪蜜柚、梁平柚、胡柚、沙田柚汁中检测到。果汁的风味不仅与挥发性组分的含量有关，也与挥发性组分的感官阈值密切相关[16]，因此，常采用OAV筛选对柚汁整体风味具有贡献的挥发性组分。在5种柚汁中特征风味物质数量不同：琯溪蜜柚(21)>沙田柚(18)>葡萄柚(16)=梁平柚(16)>胡柚(14)；琯溪蜜柚(β-紫罗酮，OAV=24 167.52)，梁平柚(正己醛，OAV=514.95)，葡萄柚(d-柠檬烯，OAV=315.11)，胡柚(1-辛烯-3-醇，OAV=111.67)，沙田柚(3-羟基己酸乙酯，OAV=43 832.55)5种柚汁中最主要特征风味物质种类也呈现不同。综上，本研究采用HS-SPME-GC-MS/PFPD结合多元数据统计方法，比较5种不同品种柚汁中挥发性组分种类、含量和香气特征的差异，明确琯溪蜜是含有特征风味组分的柚子品种，PFPD检测器的使用为柚汁中VSCs的检测方法提供了参考。此外，5种柚汁挥发性组分的研究对柚汁加工生产、柚类风味选育，都具有重要的理论指导意义。