酿酒酵母和植物乳杆菌混合发酵对金银花浸提液多酚物质的影响

金银花是忍冬干燥的花蕾,具有解热、抗炎、抗菌、抗病毒、免疫调节、降血脂和抗氧化等生理功能[1-3]。1984年国家中医药管理局将其确定为35种名贵中药材之一,后来又被定为药食两用品种。

微生物具有极强的生物转化能力,能够改善食品的风味,减弱毒性,改变食品成分[4]。液态发酵中多采用单一菌种如植物乳杆菌、酵母菌等,发酵后抗氧化性得到不同程度的提高,总多酚的含量也得到一定的提升。陈康等[5]使用植物乳杆菌对金银花进行液态发酵,发现在浸提液中的绿原酸含量基本稳定。徐文流等[6]发现,金银花经红曲霉固态发酵后,绿原酸含量增加,抗氧化能力提高。为改善食品风味,近年来混合菌种发酵应用较为广泛,在红枣汁[7]、果酒[8]、蔬菜[9]等发酵中已经取得一些较好的结果。此外由于酵母菌和乳酸菌存在协同作用及代谢交换[10],也成为国内外学者研究的热点之一。目前关于多菌混合发酵金银花的研究较少,且研究多数集中在固态发酵改变物质的风味上,发酵的结果多数以物质总量表征[11],对发酵过程中各物质含量变化情况以及如何变化鲜有报道。本研究使用酿酒酵母和植物乳杆菌混合发酵金银花浸提液,采用超高效液相色谱飞行时间质谱(ultra high performance liquid chromatography time of flight mass spectrometry,UHPLC-Q-TOF-MS)和超高效液相色谱三重四极杆串联质谱(ultra high performance liquid chromatography triple quadrupole tandem mass spectrometry,UHPLC-QQQ-MS/MS)研究发酵前后金银花浸提液的有效组分变化,为混菌液态发酵金银花提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验菌种

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum),本实验室筛选保藏。

1.1.2 实验材料

金银花,安徽皖印堂。

1.1.3 实验试剂

绿原酸(批号PCS-191210)、咖啡酸(批号PCS-200110)、阿魏酸(批号PCS-190803)、木犀草素(批号PCS-191218)、木犀草苷(批号PCS-190918)(HPLC>98%),北京世纪奥科生物技术有限公司；DPPH、ABTS,麦克林试剂;其余试剂为国药集团分析纯。

1.2 仪器与设备

ZQZY-88CV振荡培养箱,上海知楚仪器有限公司；SW MAGELLAN V7.2-SP1 TRA2PC多功能酶标仪,奥地利Tecan有限公司；LC-1290超高效液相色谱、C18超高效色谱柱(ZORBAX RRHD Eclipse Plus 2.1 mm×50 mm 1.8 μm)、LC-1290-TQ 6470 UHPLC-QQQ-MS/MS,美国Agilent科技有限公司；Tims Tof Pro飞行时间质谱仪,德国Bruker科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 种子培养

将活化后的酿酒酵母接种在PDA培养基中,32 ℃、150 r/min培养18 h待用,将活化的植物乳杆菌接种入MRS培养基中,35 ℃、150 r/min培养24 h待用,以OD600表征生物量。

1.3.2 金银花浸提液及发酵液的制备

取粉碎后的金银花,配制成质量分数为3%的浊液,水浴锅中65 ℃浸提120 min,8 000 r/min离心15 min,在上清液中添加1%的葡萄糖,使用水浴锅90 ℃消毒120 s,分别接种体积分数为2.5%的植物乳杆菌和酿酒酵母,在32 ℃、140 r/min发酵72 h获得发酵液。对照组以相同方法处理,于4 ℃冰箱保存待用。

1.3.3 黄酮含量的测定

采用AlCl3-NaNO2-NaOH比色法[12],结果以芦丁计(单位mg/mL),绘制标准曲线,回归方程Y=4.062 9x+0.037 76,R2=0.998 15。

1.3.4 多酚含量的测定

多酚含量的测定采用福林酚比色法测定[13],结果以焦性没食子酸计(单位mg/mL),绘制标准曲线,回归方程Y=18.4x+0.058 27,R2=0.993 07。

1.3.5 抗氧化活性检测

DPPH自由基清除率：参考文献[14]稍加调整。取样液2 mL于试管中,加入2 mL的DPPH溶液,空白组以无水乙醇作对照,样品溶液做参照,室温下避光反应20 min测定其在517 nm处的吸光值。清除率的计算如公式(1)所示：

DPPH自由基清除率

(1)

式中：A样品,样品组在517 nm处吸光值；A对照,对照组在517 nm处吸光值；A空白,空白对照组在517 nm处吸光值。

ABTS阳离子自由基清除率：参考文献[15]稍加调整。ABTS工作液V(7.4 mmol/L ABTS)∶V(2.6 mmol/L K2S2O8)=1∶1避光保存过夜,用无水乙醇稀释后得到工作液。反应总体系1 mL,样品0.2 mL,工作液0.8 mL,反应时间30 min,以无水乙醇做空白对照。清除率的计算如公式(2)所示：

ABTS阳离子自由基清除率

(2)

式中：A样品,样品组在734 nm处吸光值；A对照,对照组在734 nm处吸光值；A空白,空白对照组在734 nm处吸光值。

1.3.6 定性和定量分析

定性分析：使用UHPLC-Q-TOF-MS对发酵前后的浸提液进行组分分析,将对照组和发酵组进行稀释,使用0.22 μm滤膜过滤获得待测液。分析方法如下：离子源ESI源,UHPLC柱温40 ℃,进样量5 μL,流速0.3 mL/min,流动相分别为0.1%甲酸水(A)和甲醇(B)洗脱梯度(0～9 min,95%～90% A；10～20 min,75%～20%A；21～30 min,20%～10%A；30～35 min,10%～95%A)洗脱时间35 min,预实验结果显示金银花有效成分在负离子模式下响应较好,故TOF-MS采用负模式进行检测。质谱检测结果使用Metabo Scape软件进行谱库检索以及调取对应的二级碎片离子参考相应文献[2]确定对应物质。

定量分析：使用LC-MS对相应物质进行定量。液相条件：HPLC柱温40 ℃,进样量5 μL,流速0.3 mL/min,流动相分别为0.1%甲酸水(A)和甲醇(B)洗脱梯度(0～6 min,95%～92%A；6～10 min,92%～75%A；10～15 min,75%～60%A；15～20 min,60%～45%A；20～30 min,45%～15%A；30～40 min,15%～95%A)洗脱时间40 min。MS条件：干燥气流速5.0 L/min,温度300 ℃,鞘气流速11.0 L/min,温度250 ℃,喷雾气45.0 psi,毛细管电压3 500 V(-),正模式4 500 V(+)。各物质质谱检测条件及标准曲线见表1。

表1 标准曲线及质谱条件

Table 1 Standard curves and mass spectrometry measuring conditions

2 结果与分析

2.1 菌体生长及pH变化

由图1可知,对照组OD600和pH变化不显著,发酵组OD600与pH变化明显；发酵组菌体快速增长并在24 h达到最大值,24 h后生物量维持相对稳定,发酵组pH在12 h内剧烈下降,由4.9下降至3.5。

a-对照组；b-发酵组

图1 发酵过程中菌体量及pH变化

Fig.1 Changes of biomass and pH during fermentation

2.2 金银花发酵浸提液不同时间多酚和黄酮含量的变化

如图2所示,对照组黄酮和多酚含量呈现轻微下降趋势,分别由71和48 mg/g下降至67和47 mg/g,发酵组黄酮由72下降至65维持至24 h,24 h后逐渐回升增高由65提升到79 mg/g；多酚呈现出明显上升趋势,由47.7提升到59.4 mg/g。

a-对照组；b-发酵组

图2 发酵过程中黄酮和多酚的含量变化

Fig.2 Concentration changes of total flavonoids and polyphenols during fermentation

2.3 发酵金银花浸提液不同时间自由基清除能力的变化

经发酵后金银花浸提液的抗氧化能力发生改变,结果如图3所示,在DPPH自由基清除实验中,对照组在0～72 h内整体相对稳定,发酵组的DPPH自由基清除率在各时间点均高于对照组,由初始的60%提升到71%,提升显著；ABTS阳离子自由基清除实验中发酵组的清除率在12 h时低于对照组,12 h后清除率较对照组得到提高。

a-DPPH自由基清除率；b-ABTS阳离子自由基清除率

图3 发酵过程中自由基清除能力变化

Fig.3 Changes of free radical scavenging ability during fermentation

2.4 发酵前后金银花浸提液组分定性结果

使用UHPLC-Q-TOF-MS分析对照组和发酵结束(72 h)浸提液的组分变化,以火山图和热图的形式展示结果(图4)。火山图展现出对照组与发酵组有较大的改变。由热图分析发现,发酵后浸提液中3,5-二咖啡酰奎尼酸、阿魏酰奎尼酸、木犀草素、莽草酸、脱氢莽草酸、肉桂酸等的含量有明显的提升(P<0.05),葡萄糖、甘露糖、蜜二糖、塔罗糖、奎尼酸、香豆素、木犀草苷、当药苦苷等的含量有着明显的降低(P<0.05)。十四烷二酸、十三碳二元酸、十二碳二元酸、壬二酸等二元酸的含量也有较明显的提升(P<0.1)。

a-火山图；b-组分热图

图4 对照组与发酵组火山图及组分热图的比较

Fig.4 Comparison of volcanic map and component heat map between the control and fermentation group

2.5 金银花有效组分的定量分析结果

依据2.4的检测结果,选取金银花的有效成分,使用LC-MS的多反应监测模式对发酵前后绿原酸、木犀草苷、木犀草素、阿魏酸、咖啡酸进行测定,结果如表2所示。5种物质含量的变化与TOF-MS的检测结果吻合,金银花浸提液经发酵,绿原酸含量由26.566 mg/g提升到31.338 mg/g,提升17.96%；木犀草苷由0.897 mg/g下降至0.063 mg/g；阿魏酸、咖啡酸和木犀草素的含量有所提高。

表2 发酵组的LC-MS定量结果

Table 2 Quantitative results by LC-MS of fermentation group

3 结论

采用UHPLC-Q-TOF-MS对金银花浸提液的成分进行定性分析,发现发酵使得浸提液的组分发生改变。其中有191种物质含量下降,182种物质含量上升。奎尼酸的含量明显下降(P<0.05),但莽草酸的含量却在明显增加(P<0.05),证明奎尼酸在发酵的过程中被利用。同时阿魏酰奎尼酸、绿原酸含量提升明显(P<0.05),因此在发酵的进程中可能产生了一些酶类,能够使咖啡酸和阿魏酸与奎尼酸反应,从而提高绿原酸和阿魏酰奎尼酸的含量。由木犀草苷含量的变化与木犀草素的变化推测,在发酵进程中产生某些物质能够将苷类物质的糖苷降解,暴露出苷元,当药苦苷、马钱苷含量的降低也源于此。

本研究采用植物乳杆菌和酿酒酵母混合发酵金银花浸提液,浸提液经发酵后,黄酮的含量提升10%、多酚的含量提升了24%；抗氧化性能得到提高,自由基清除率得到一定的提升,DPPH自由基清除率由55%提升到71%,ABTS阳离子自由基清除率由59%提升到64%；此外,部分糖苷类化合物被降解,分子量变小更易被吸收利用。因此,采用混菌发酵的方法能够提升金银花浸提液的品质,同时也为金银花饮品的开发提供了理论基础。