基于多肽的药物递送系统研究进展

药物递送系统是将药物输送到药物作用靶点的系统^[1]，可以调节药物的代谢动力学、药效、毒性、免疫原性等^[2~4]. 药物递送系统通常可以提高药物的稳定性；减少药物的降解；减轻药物的毒副作用；提高药物的生物利用度；维持稳定有效的血药浓度；避免血药浓度波动，同时可以提高靶区的药物浓度^[5~9].

理想的药物递送系统应具备载药量高、运输过程中药物泄漏量低、有效靶向病灶部位以及药物可控释放等特点. 药物递送系统近年来已成为医药领域的研究热点，有望为各种重大疾病的精准治疗提供新思路.

多肽是一种较为常见天然聚合物，一般由多个氨基酸组成，并且可以通过氢键形成二级结构(α螺旋，β折叠). 多肽可通过固相合成法制备，方法简单. 多肽具有生物活性，同时具有易代谢、免疫原性低、毒副作用低的优点.

多肽作为新兴的药物递送系统的构筑基元具有较高的生物活性. 它们的侧链上能够携带多种活性官能团(羧酸、羟基、氨基和硫醇基)，可以进行各种化学修饰，从而实现药物递送系统的功能^[10~12]. 多肽作为药物递送系统引起了广泛的研究兴趣，展示了巨大的应用潜力^[13~17]. 本文根据多肽的功能进行分类(图1)，对不同功能的多肽药物递送系统进行介绍，包含分子和纳米递送系统，不同功能多肽的联用. 其中，组装多肽是本文介绍的重点.

Fig.1  Classification of typical functional peptide drug delivery systems.

1 靶向肽

一直以来，将药物递送至靶器官、靶细胞甚至是细胞器，提高药物作用效果并降低给药剂量和毒副作用是药物递送的重要研究方向(图2). 在靶向递送的研究中，通常利用靶向部位高表达或者特异性表达的生物标志物作为靶标，再利用具有靶向性的分子、抗体、多肽实现对靶标的特异性结合. 具有靶向性的多肽与药物相连接所形成的靶向药物递送系统备受关注.

Fig. 2  Schematic diagram of the interaction between targeted peptide drug delivery system and cells. Overexpression of receptors (such as folate EGFR, Her2 and transferin receptors) makes cancer cells more susceptible to the targeted delivery system than normal cells.

多肽-药物偶联物(PDC)是一类新兴的靶向药物. PDC是通过可切割的片段将靶向肽与药物共价连接而成. PDC是由多肽组成的，因此是可生物降解的，且具有较低的免疫原性. 多肽的多样性赋予了PDC的多样性，可以针对不同的靶点设计PDC，通过调整肽链的氨基酸组成和序列，可调节PDC的水溶性和细胞通透性等性质，进而影响PDC在体内的生物利用度^[18]. 通过靶向多肽和药物偶联形成的PDC在基础研究领域十分活跃^[19]，部分药物已经进入临床实验阶段，2款药物已经上市. 如Lutathera一种放射性药物，是利用同位素镥177标记的长效奥曲肽类似物主要用于治疗神经内分泌肿瘤^[20]. Melflufen是一种能够靶向氨肽酶(aminopeptidase)的多肽药物偶联物，它能够迅速地将烷化剂felphalan(马法兰)有效地传递到骨髓瘤细胞中^[21].

在乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌和前列腺癌中促黄体生成释放激素(LHRH)受体过度表达，这为靶向LHRH并将药物递送到癌细胞的多肽药物递送系统提供了便利. 将阿霉素(DOX)和2-吡咯啉-DOX与LHRH靶向肽结合可显著增加药物对癌细胞的靶向性^[22]. 类似地，Lindgren等将YTA2 (YTAIAWVKAFIRKLRK)和YTA4 (IAWV

KAFIRKLRKGPLG) 2条多肽(图3(a)和3(b))与甲氨蝶呤共价连接形成PDC，甲氨蝶呤是一种叶酸拮抗剂，减少叶酸底物会损害嘌呤核苷酸的合成，从而抑制DNA合成减少细胞增殖. 与游离的甲氨蝶呤相比，PDC治疗效果提高了15~20倍^[23].

Fig. 3  The molecular structures of functional peptides: (a) YTA2 and (b) YTA4.

靶向肽还可以作为纳米药物递送系统的靶向基团. 利用靶向肽可以特异性识别靶标的能力，准确地将药物递送到靶器官或靶细胞，从而提高了靶区的药物浓度，并降低了对正常细胞的杀伤力；提高了药物的治疗效果，并降低了药物的副作用. Wang等制备了一种肝癌细胞靶向肽glypican-3 (ALLANHEELFQT)，并将glypican-3连接到负载了索拉非尼(一种肿瘤治疗药物)的纳米药物递送系统上，从而达到靶向肝癌细胞的目的，用于肝细胞癌的治疗^[24]. 此外，Wong等在纳米药物递送系统表面连接了3种不同的靶向肽. 这3种多肽可以同时靶向Epstein-Barr病毒核抗原EBNA1潜伏感染膜蛋白LMP1，同时实现了癌细胞的检测与靶向治疗^[25]. Lee等制备了一种ErbB2靶向肽并将其连接到脂质体上. 他们用该ErbB2靶向脂质体负载抗癌药物雷帕霉素，显著改善了雷帕霉素的溶解性与药代动力学特征. ErbB2靶向肽修饰的脂质体有可能成为治疗ErbB2阳性乳腺癌的有效药物递送系统^[26].

2 穿透肽

穿透肽进入细胞的途径主要有2种：胞吞途径和直接穿透途径. 在胞吞途径中，首先磷脂双分子层内陷，并将穿透肽包裹起来形成小囊泡，从而进入细胞中，或者依靠形成反向胶束进入细胞中. 相比之下，直接穿透路径就简单得多，一种是依靠穿透肽的极性直接在磷脂双分子层上穿孔，另一种是穿透肽像地毯一样铺在磷脂双分子层的表面，靠与磷脂双分子层融合进入细胞.

穿透肽是一类能携带大分子物质进入细胞的多肽，其穿透能力不依赖于经典的胞吞作用. 例如：具有螺旋结构的阳离子穿透肽与细胞膜表面上的阴离子官能团相互作用，能够促进细胞膜的直接渗透作用或能量依赖的内吞作用，从而引发细胞有效地吸收细胞穿透肽(图4)^[27]. 将肿瘤靶向肽与细胞穿透肽结合，可以选择性地将毒素或前药分子靶向运输到特定组织和细胞中，从而提高治疗效率，减少副作用^[28,29]. Makoto等设计了一种具有两亲性螺旋结构的穿透肽，这种肽依赖其两亲性螺旋结构可以高效地将核酸递送到人肝癌细胞中^[30].

Fig. 4  Schematic diagram of penetrating peptides into cells.

Langel课题组结合乳腺肿瘤靶向肽(PEGA, (cCPGPEGAGC)/CREKA)和穿透肽^[31]设计并制备了具有肿瘤细胞特异性的嵌合肽，可显著增强药物递送能力(图5(a)). LyP-1 (CGNKRTRGC)^[32]和HN-1 (TSPLNIHNGQKL)^[33]也是这类嵌合肽(图5(b)和5(c))，它们可以选择性地识别头颈部鳞状细胞癌细胞和前列腺癌细胞，同时具有穿透被识别组织细胞膜的能力. 这种具有双重功能的多肽已经成为靶向肿瘤治疗领域非常重要的药物递送系统. 此外，阳离子双亲性穿透肽还可以通过静电相互作用与阴离子生物大分子(如DNA和RNA)相互作用，形成纳米级离子复合物，用来传递基因和核酸.

Fig. 5  The molecular structures of functional peptides: (a) PEGA, (b) LYP-1, (c) HN-1.

3 响应肽

响应肽通常指在外界环境变化(例如pH、酶、温度和氧化还原反应)时做出的分子结构或组装结构改变的多肽. 近年来，抗体药物偶联物(ADC)通过响应肽实现释放药物的研究越来越多^[34~37]. Advani等构建了一种ADC，将DNA损伤反应抑制剂AZD7762连接到马来酰亚胺基己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄基氨基甲酸酯(MC-VC-PABC)这种典型的包含响应多肽的分子上，再将其连接到西妥昔单抗上. 这种ADC经过受体介导的内吞作用后，再由溶酶体内组织蛋白酶B裂解MC-VC-PABC分子内的缬氨酸-瓜氨酸二肽以释放药物AZD7762. 在聚焦靶向电离辐射的作用下，该药物显著增强了对癌细胞的杀伤力，同时还具有放射增敏的作用^[38]. Chen等构建了靶向凝血肽(GNQEQVSPLTLLKXC，称为A15)修饰的聚(L-谷氨酸)-马来酰亚胺聚(乙二醇)/康普瑞汀A4缀合物(A15-PLG-CA4)，并建立了链式反应机制放大纳米治疗性肿瘤归巢的策略. 具体而言，A15是谷氨酰胺转移酶(FXIIIa)的底物，该酶通过FXIIIa催化的谷氨酰胺转移与血凝块结合，引导A15-PLG-CA4进入肿瘤，从而在肿瘤中释放更多的CA4. 肿瘤归巢的A15-PLG-CA4可激活更多的FXIIIa(靶标)，并用于A15肽的转谷氨酰胺化作用. 另外，由于FXIIIa可以很容易地被循环中的纳米药物所利用，A15-PLG-CA4可以选择性地增加肿瘤中靶标数量，这种自我放大的靶向肿瘤策略为开发有效靶向肿瘤能力的下一代纳米治疗药物开拓了道路^[39].

在响应肽纳米递送系统中，Nishimura等报道了一种可以促进溶酶体逃逸的多肽GALA (WEAALAEALAEALAEHLAEALAEALEALAA)，结构见图6(a)^[40]. 该多肽为两亲性的pH敏感型多肽，当pH为7时由于负离子的排斥力，GALA肽呈无规则的卷曲结构，当pH为5时由于谷氨酸残基被质子化而呈α螺旋结构. 如果将GALA肽偶联到生物纳米微囊表面，可以使生物纳米微囊获得溶酶体逃逸的能力，从而提高携载药物的胞内输运效率. 低pH插入肽(pHLIP)是一种潜在的特异性靶向肿瘤的系统，它不依赖于肿瘤特异性抗原的表面表达，而是一种基于pH的递送系统. 它利用肿瘤微环境的酸性条件来选择性递送药物. Phalloidin和α-amanitin是不能穿透细胞膜的极性环状毒素，可作为细胞增殖抑制剂和抗癌剂. 尽管它们具有抗癌特性，但由于缺乏肿瘤细胞特异性，而且无法穿透细胞膜，因此它们不能在治疗中使用. 这些毒素与pHLIP简单偶联后可以有效地被递送到细胞质中，并且在多种肿瘤模型中表现出很高的疗效^[41]. 基质金属蛋白酶(MMP)是一类在侵袭性肿瘤部位高表达而在正常细胞中表达水平较低的肿瘤标志物^[42]. MMP敏感的八肽pp(GPLGIAGQ) (图6(b))的引入能够使药物递送系统在MMP高表达的特定组织释放药物. Zhu等设计了一种MMP响应型的多功能自组装多肽聚合物PEG-ppTat-DOX (Tat为细胞穿透肽，DOX为阿霉素)，该多肽聚合物自组装形成纳米颗粒表面层由PEG构成，可以避免载药纳米颗粒被快速清除，延长其在血液中的循环时间. 当药物到达肿瘤周围，MMP响应肽pp被特异性剪裁，随后释放Tat-DOX. 此外，穿透肽Tat可以促进小分子化疗药物DOX在肿瘤组织的吸收并增强化疗药物治疗效果^[43].

Fig. 6  Schematic diagram of the molecular structure of response peptides (a) GALA and (b) pp.

4 组装肽

20世纪70年代，法国科学家Lehn提出了“超分子化学”概念，即分子可以通过非共价相互作用，包括离子、疏水性、氢键和π-π堆叠等自组装形成超分子结构. 多肽本身具有丰富的超分子作用：包括苯丙氨酸、亮氨酸等的疏水作用；带正电的赖氨酸和精氨酸和带负电的天冬氨酸和谷氨酸可以提供的静电相互作用；连接多肽分子的酰胺键可形成分子内或者分子间氢键. 这些丰富的超分子相互作用，可以使多肽自组装形成纳米结构，从而提升多肽的生物学功能^[44]. 具有自组装结构的多肽纳米材料比多肽本身具有更高的稳定性、更长的血液循环时间，更好的靶向性以及更佳的治疗效果等^[45,46].

4.1 离体多肽水凝胶

利用多肽与药物的结合物构建的自组装超分子凝胶，通过病灶局部的原位给药，可以有效地增加药物在病灶部位的浓度，延长药物的作用时间. 例如：Liu等成功设计并制备了一种通过I₃K (Ac-IIIK-NH₂，一种两亲性的自组装肽)自组装纳米管，利用其自组装性能构建了高载药量并且具有响应释放特性的纳米递送系统^[47]. Xu等设计了一种奥沙拉嗪三肽结合物，利用其自组装性能成功制备了可实现药物长效控制释放的超分子水凝胶^[48]. Chen等将非甾体抗炎药酮洛芬与自组装多肽相结合构建了超分子纳米凝胶药物，用于关节炎的治疗. 纳米凝胶经关节腔注射后可延长滞留时间达30天以上，在更好地发挥药效的同时具有更低的毒性^[49]. Zhong等设计并制备了一种八肽(FHFDFHFD)水凝胶，用来递送抗癌药物丹参酮. 该水凝胶具有优异的机械性能、简单的凝胶化过程、可控的胶化时间和高可回收率，是一种有潜力的药物递送系统. 以上经典多肽水凝胶大多包含疏水氨基酸，如苯丙氨酸、异亮氨酸和亲水氨基酸，如赖氨酸、天冬氨酸. 亲水氨基酸提高多肽的水溶性，疏水氨基酸则拉近肽链，使多肽形成分子间氢键，最终形成纤维网络水凝胶.

4.2 体内原位组装肽

如何将药物精确高效地输送到病灶中，仍然是一个巨大的挑战. 自组装多肽作为药物递送系统有很多优点，有望实现精准递送. 能够承受和适应复杂的生物环境并实现自组装过程的精准调控是药物递送的关键^[50]，为此，研究者提出了体内原位组装的策略，根据驱动组装的因素可以分为以下几类：

(1) 化学反应诱导

Liang课题组设计了一种新型的多肽智能探针^[51]，如图7所示，该探针分子Acetyl-R-V-R- R-C(StBu)- K(18F-FB)-CBT (1)利用肿瘤细胞的还原环境和弗林蛋白酶进行自组装，形成放射性纳米粒子(即1-NPs)，可增强荷瘤小鼠的microPET成像. 与无自组装的多肽探针相比，注射相同剂量的多肽智能探针，荷瘤小鼠显示出更高的药物摄取和更慢的放射活性衰减. 所以，化学反应诱导的自组装多肽策略可以帮助研究人员在更长的时间内跟踪重要的生物标志物.

Fig. 7  Reduction and furin linkage control in situ condensation process and the process of assembly to form nanoparticles (Reprinted with the permission from Ref.[51]; Copyright (2015) Ivyspring International Publisher).

Wang等使用一种识别-反应聚合(RRA)的策略在肾癌细胞(RCC)膜上构建多肽超分子结构，从而扰乱细胞膜的渗透性，同时增强肾癌细胞对化疗药物的敏感性. 此策略分为三步：首先，通过多肽P1-DBCO(SCYNTNHVPLSPKY-二苯并环辛炔)对RCC细胞膜表面的碳酸酐酶IX (CAIX)的靶向能力来识别RCC. 随后引入多肽P2-N₃(N₃-APIAQKDELE-KLVFFAE-Cy)与P1- DBCO反应生成多肽P3. P3是由叠氮基团N₃和DBCO基团反应形成的，所以P3具有较强的疏水性，在其生成的同时可自组装形成超分子结构. 自组装多肽打破了细胞膜表面的亲水-疏水平衡，扰乱其完整性和渗透性，使细胞可摄取更多的化疗药物阿霉素. 相比直接用阿霉素进行治疗，使用RRA策略进行治疗的阿霉素的IC₅₀降低了3.5倍，显著抑制了小鼠的肿瘤生长，抑制率增加了3.2倍^[52].

(2) 酶的裁剪

由于酶的特异性，酶参与诱导的自组装也是一种有效的药物递送系统. 无论细胞外环境还是细胞内环境，磷酸酶都已被广泛用于控制水凝胶的形成，被称之为“酶促组装”策略^[53]. Xu课题组通过酶促反应可逆地调节了基于自组装多肽的水凝胶. 他们还通过迈克尔加成反应将阿霉素与马来酰胺连接到一起，再通过酯-酰胺交换反应将耦合物和紫杉醇连接到同一个肽链上，最后在碱性磷酸酶(ALP)的催化下进行去磷酸化反应后，自组装形成稳定的水凝胶，这项工作建立了共价连接的阿霉素和紫杉醇的递送系统的新策略. 卟啉是一种具有自组装性质的疏水分子，它是一种可用于光热疗法和光声成像的诊疗剂. Wang课题组设计了一种明胶酶响应的紫嘌呤-18(P-18)多肽，该分子的序列是P18-PLGVRGRGD. 小鼠尾静脉注射后，分子可以借助RGD配体靶向肿瘤部位，随后由肿瘤微环境中过表达的明胶酶选择性的裁剪. 剪切后生成的P18-PLG可以自组装形成纳米纤维，表现出更强的光声成像信号和更好的光热治疗效果. 这种方法被称之为“体内自组装”策略^[54].

Wang课题组还制备了一种能够增强靶向药物富集和滞留的可形貌转化的多肽材料CPT-LVFFGFLG-PEGRGD(CPT-LFPR)，图8展示了其作用原理. 纳米颗粒(CPT-LFPR)经静脉注射到荷瘤小鼠体内，通过靶向多肽的作用在特定组织积累，在组织蛋白酶CtsB (CtsB，在多种肿瘤中过表达的一种溶酶体蛋白酶)的作用下选择性地剪裁特定多肽，从而脱掉PEG-RGD外壳，使得残基重组装形成具有β折叠结构的纤维. 这些纤维在肿瘤中可以作为“种子”，加速后续的纳米粒子转化速率，进一步增加药物在肿瘤细胞中的富集和滞留，能够在体原位构建出纤维药物库. 最后，纳米纤维能够在肿瘤细胞内持续释放药物，有效抑制肿瘤生长. 通常，基于成核的自组装动力学行为的特征包括缓慢成核期和快速生长期，其中成核期是速控步骤. 该研究通过添加“种子”跳过了成核过程，加速了纤维的增长，因此该策略可用于快速构建纳米多肽药物递送系统^[34].

Fig. 8  Kinetic behavior of nucleated self-assembly. (Reprinted with the permission from Ref.[34]; Copyright (2019) American Chemical Society).

(3) pH值

肿瘤细胞具有较高的糖酵解速率，其产物为乳酸. 所以大多数肿瘤周围的环境比正常生理环境pH(7.4)酸性更高，通常pH在5.5~6.5之间. 因此可以通过酸不稳定的材料将药物与纳米递送系统结合或通过将药物封装在pH依赖的递送系统中而释放出来. 据报道L-苯丙氨酸二肽是一种有效的水凝胶剂，它具有较好的生物相容性，而且L-苯丙氨酸二肽在酸性条件下可以自组装成超分子水凝胶^[55]. 此外，Stupp等开发了一种pH敏感的自组装多肽，pH的变化可以调控自组装肽两亲物(PAs)的纳米结构的形状. 通过在肽链的脂肪族尾基上引入pH敏感的低聚组氨酸序列(H₆)的方法，研究者设计了2种自组装形态不同的PAs，一种是纳米纤维(PA1)，另一种是球形胶束(PA2)，分子结构见图9. 在酸性溶液中，组氨酸残基质子化，这时组氨酸的正电荷会破坏纤维形成β-折叠所需氢键并导致PA1纤维的分解. PA2是球形胶束，在组氨酸质子化时由于静电排斥作用破坏了胶束的稳定性导致胶束解散. 这2种解散都是可逆的，当溶液pH恢复中性，单体分子会重新自组装成为纤维或球形胶束. 2种胶束相比，纤维型胶束具有更好的药物封装性能^[56].

Fig. 9  Schematic diagram of the molecular structure of pH-responsive peptides: (a) PA1 and (b) PA2.

Wang等提出了一种可pH响应的自组装多肽(图10)，这种多肽在pH值为7.4时会自组装成纳米粒子(NPs). 静脉注射后，这些NPs会通过被动靶向机制富集在肿瘤区域，由于肿瘤微环境的pH值较低，NPs在酸性环境下可以形成纳米纤维结构(NFs). 同时这个NFs的网状结构可以通过疏水或者π-π相互作用捕获一些小分子物质，最终实现了疏水药物分子在肿瘤区域富集和滞留，进而提高了治疗效果^[57].

Fig. 10  Schematic diagram of pH- responsive peptide in situ deformation and drug loading (Reprinted with the permission from Ref.[58]; Copyright (2017) WILEY-VCH).

(4) 配受体相互作用

纤粘连蛋白FN (fibronectin)是将细胞与细胞外基质ECM (extracellular matrix)中的胶原纤维连接起来的重要的组分. FN由细胞分泌，随后与整合素受体结合形成天然的纤粘连蛋白纤维. FN纤维的形成是由于细胞表面的受体和FN的配体相互作用引发的原位组装过程. Wang等利用BP-KLVFF-RGD(图11(a))多肽模拟FN纤维化过程，在整合素过表达的U87细胞表面将BP-KLVFF-RGD从纳米颗粒转变为纳米纤维，原位形成的纳米纤维可能导致细胞失巢凋亡^[58].

Fig. 11  The molecular structure of response peptides: (a) BP-KLVFF-RGD, (b) NBD-FFYEGK and (c) NBD-FFYEEGK.

万古霉素由于可以特异性结合革兰氏阳性细菌的细胞壁，通常用来诊断和治疗细菌感染^[59]. Xu课题组报道了第一种抗生素凝胶剂：万古霉素-芘(Van)，这种抗生素甚至对耐万古霉素的肠球菌也显示出有效的抗菌活性^[60]. 与此同时，Yang等分别比较了2种NBD-Van偶联物NBD-FFYEGK(Van)和NBD-FFYEEGK(Van)的抑菌能力，其结构式见图11(b)和11(c). 研究发现，肽-Van偶联物的抗菌活性取决于其自组装能力，细菌表面的自组装能力越强，抗菌活性就越大^[61].

自组装肽具有灵活的响应能力，基于自组装肽的组装前体可以通过pH变化、酶反应、化学反应和生物表面受体诱导等方法自组装成各种纳米药物递送系统^[62]. 研究者可以根据不同需求更加精确地选取组装多肽用于药物递送系统. 自组装多肽性质的引入可以赋予多肽药物更高的生物活性^[63]、特殊的环境响应性^[64]、缓慢释放特性和更强的稳定性等优点^[65]. 自组装肽的诸多优点使其在药物递送系统中展示出巨大潜力^[66~72].

5 总结与展望

本文综述了多肽类药物递送系统的研究进展. 基于多肽的药物递送系统具有良好的生物相容性、丰富的官能团、固有的生物活性以及特异的靶向性等优点. 多肽在药物递送系统中有着广泛的应用，迄今为止，关于多肽药物递送系统的研究大多是基于其靶向性或穿透性等固定属性，而响应肽及组装肽在内源性或者外源性刺激下更加智能更加精准的递送药物还有待进一步的研究. 利用体内天然化工厂的条件，即物理化学刺激因素调控药物递送及释放策略显然已经成为当前的研究热点.

多肽类药物递送系统虽然已经取得了很大的进展，但仍需克服几个问题，例如：多肽的易降解性；体内循环半衰期短；如何精确控制多肽纳米递送系统的尺寸和形态；响应多肽的敏感性；精准控制体内行为等. 因此开发长循环、抗黏附、特异性靶向以及精准高效组装多肽成为未来研究的重点. 我们相信多肽类药物递送系统将来一定可以实现临床转化.