基于金属有机框架载体的免疫球蛋白G印迹材料的构筑及其识别性能研究

作者：宋文琦杨雨璇刘文倩钱立伟来源：《高分子学报》日期：2022-06-17人气：1648

从2019年底至今，席卷全球的新型冠状病毒已给我国人民造成了巨大的人身伤害和经济损失. 在当前病毒依然肆虐之时，新型冠状病毒的便捷、精准检测成为我国公共卫生安全保障和社会经济复苏的关键. 血清抗体检测具有方便快捷、用时较短等优势，是目前核酸检测的有效补充手段. 然而，在血清检测中可对免疫球蛋白G和免疫球蛋白M抗体进行特异性识别的单克隆抗体，制备过程繁琐、价格昂贵、贮存稳定性较差，这些都成为制备廉价、高效的血清抗体检测装置的阻碍. 因此，寻求可替代单克隆抗体的蛋白识别新材料具有重要意义.

分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymers，MIPs)具有制备简单、成本低廉、产品性能稳定等优点，成为替代生物抗原-抗体识别作用的良好选择^[1]. MIPs是通过聚合物中构筑与模板分子形状、大小以及官能团具有相互匹配功能的印迹孔穴，来实现对特定蛋白的识别. 在分子印迹领域中，以小分子为模板的分子印迹技术发展较为成熟，已成功应用于生物传感器、固相萃取、医学诊断等领域^[2,3]. 然而，以蛋白质分子为模板的分子印迹技术，由于模板蛋白庞大的分子体积和复杂的表面结构，所制备的MIPs的识别性相对较低，不利于它的实际应用，怎样提高蛋白印迹聚合物的识别性，是目前该领域研究者关注的关键问题.

表面印迹策略是在基质材料表面进行印迹层聚合的方法. 此策略的提出保证了模板蛋白的洗脱和传质过程基本位于或接近于印迹材料的表界面，降低了模板蛋白的传质阻力，因此能有效地提高印迹材料的识别性^[4,5]. 近些年来，将模板固定化法与表面印迹技术结合的蛋白印迹材料制备策略成为热点. 这主要是因为：(1)通过蛋白的固定化，使其位于基质材料表面相似位置与高度，因而有利于实现印迹层厚度与识别性、模板洗脱能力之间的规律调控；(2)通过调节基质表面官能团种类和数目，可有效增强蛋白的固载量，从而提高MIPs中印迹孔穴数目与识别性^[6,7]. 例如：西北大学的陈方方，以醛基功能化的Fe₃O₄磁性微球为载体，多巴胺为功能单体和交联剂，通过表面印迹技术与模板固定化相结合的策略，制备了具有优异识别性(印迹因子4.54)、良好吸附量(最大吸附量70.2 mg/g)的人血清白蛋白MIPs^[8]. 然而，上述性能优异的载体材料，由于蛋白负载或接枝印迹层的需求，其制备过程相对复杂. 此外，进一步提高载体的比表面积也是该策略实现高性能MIPs构筑的关键.

金属有机框架材料(metal organic frameworks，MOF)，是一类由金属离子与有机配体合成的多孔纳米材料^[9]. 它具有极大的比表面积和丰富的表面官能团，并且制备简单、改性方便，是成为模板固定化策略中载体的良好选择. 然而，到目前为止，将MOF作为蛋白固定化载体用于构筑高识别性蛋白印迹材料的报道依然较少^[10,11].

此外，与传统小分子模板相对单一以及有限个数的官能团相比，蛋白质结构复杂，表面富含多种性质的氨基酸残基，因而不可避免的能与印迹孔穴之外的材料表面产生作用，造成非特异性吸附，引起MIPs识别性的降低. 怎样降低MIPs中非印迹区域与蛋白之间的相互作用是提高其识别性的有效方法. 两性离子材料是一类新型的蛋白“惰性”作用材料，这类材料通过两性离子官能团与水分子的水合作用，在材料表面形成水壳层，有效阻碍了蛋白与材料之间的相互作用^[12]. 利用上述原理，西北工业大学张秋禹团队成功将两性离子单体，2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine, MPC)引入牛血清白蛋白印迹微球的制备过程中，获得非印迹区域富含“惰性组分”的印迹材料^[13]. 与未加入MPC的印迹微球相比，基于MPC制备的MIPs显示出对模板蛋白更加优良的识别能力.

本文以免疫球蛋白G (Ig G)作为模板分子，以表面修饰双键官能团的MOF材料UIO-66作为载体，丙烯酰胺、甲基丙烯酸作为功能单体，磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯(SBMA)为两性离子单体，N,N-亚甲基双丙烯酰胺作为交联剂，采用模板固定化与表面印迹技术结合策略，拟构筑高性能蛋白印迹材料. 利用傅里叶红外光谱、扫描电子显微镜等手段系统地表征了MIPs的化学结构和物理形貌，并通过吸附等温实验和动力学实验研究了印迹材料的吸附性能. 最后，采用选择性吸附实验和竞争吸附实验检测了MIPs对Ig G的选择性和特异识别性.

1 实验部分

1.1 主要原料和仪器

人免疫球蛋白G (Ig G，纯度95%，M_w=150 kDa，pI=8.0)，辣根过氧化物酶(HRP，纯度98%，M_w = 40 kDa，pI=7.2)，卵清白蛋白(OVA，纯度98%，M_w = 45 kDa，pI=4.7)，人血清白蛋白(HSA，纯度98%，M_w = 66 kDa，pI=4.8)和细胞色素C (Cyt C，>纯度95%，M_w=10.5 kDa，pI=12.5)购自Sigma-Aldrich公司. 四氯化锆(ZrCl₄)和2-氨基对苯二甲酸(H₂BDC-NH₂)，分析纯，购自上海麦克林生物化学技术有限公司；N,N,N',N'-四甲基二胺(TEMED，纯度98%)、N,N'-亚甲基双丙烯酰胺(MBA，纯度98%)、丙烯酰胺(AAm，纯度98%)、甲基丙烯酸(AM，纯度98%)、过硫酸铵(APS，纯度98%)购自国药化学试剂有限公司；3-二甲基-(甲基丙烯酰氧乙基)丙烷磺酸铵(SBMA，纯度99%)和甲基丙烯酸酐(MA，分析纯)购自上海阿拉丁化学试剂有限公司；整个过程中都使用去离子水；所有其他溶剂和洗脱剂，如N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，氯仿和乙醇至少是分析级的，无需进一步处理即可使用.

傅里叶变换红外光谱(FTIR)采用Bruker公司所生产的TENSOR27型号FTIR分光计来测量. X射线光电子能谱(XPS)采用Kratos Axis Ultra DLD仪器来测量样品的化学组成. 样品的晶体结构通过Bruker公司生产的D8 Advance型X射线衍射仪(XRD)来检测. 热重(TG)表征通过日立公司的STA200RV型热重分析仪来测试. 紫外吸收光谱(UV)通过紫外分光光度计(Varian, Cary-1E)来测量. 材料的动态光散射(DLS)检测通过Malvern公司的Zetasizer Nano ZS来完成，该设备配备了波长为633 nm的激光，散射角为173°. 电子扫描显微镜(SEM)的测试采用Oxford公司生产的Inca Oxford型号电子扫描显微镜来完成. 材料的比表面积通过Micromeritics公司的ASAP 2460型氮气吸附-解析仪通过Brunauer-Emmett- Teller (BET)方法来测量. 采用DYY-6C电泳系统(北京六一仪器厂)进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测.

1.2 UIO-66的合成与功能化

通过溶剂热法合成了UIO-66纳米粒子^[14]，具体实验过程如下：首先，在三颈圆底烧瓶中混合191 mg ZrCl₄、146 mg H₂BDC-NH₂和82 mL DMF；然后，在搅拌下加入4.83 g乙酸，反应体系在25 ℃下搅拌30 min；随后，将混合物转移到有聚四氟乙烯内胆的不锈钢高压釜中，将高压釜放入马弗炉中于120 °C加热24 h；冷却后，将纳米颗粒用DMF和甲醇分别洗涤3次，并在60 ℃下真空干燥. 为了在其表面引入乙烯基官能团，将0.60 g UIO-66纳米粒子进一步分散在50 mL氯仿中，随后添加2.46 g甲基丙烯酸酐和0.20 g三乙胺. 将混合物在55 ℃下搅拌并回流24 h后，将产物离心并用氯仿洗涤3次，并在60 ℃下真空干燥过夜，获得乙烯基官能团功能化的UIO-66-MA.

1.3 蛋白印迹材料UIO-66@MIPs的制备

将20 mg的UIO-66-MA纳米颗粒静置于10 mL含浓度为3 mg/mLIg G的磷酸盐缓冲液(pH=7.0，10 mmol/L). 25 ℃恒温震荡3 h后，通过离心分离纳米颗粒，并用去离子水洗涤. 随后，将负载Ig G的UIO-66纳米颗粒分散在10 mL磷酸盐缓冲液(pH=7.0，10 mmol/L)中，随后加入35.5 mg AAm，34.4 mg AM，10 mg MBA和一定质量的SBMA. 将预聚合溶液在25 °C下静置1 h，然后添加20 μL TEMED和20 mg APS. 反应溶液在25 ℃下将搅拌24 h后，将产物离心. 在室温下用0.5 mol/L的NaCl溶液和乙酸溶液(6.0 vt%)交替洗涤，直至洗脱液无法在紫外分光光度计中检测到蛋白特征峰强度(280 nm). 最后，用去离子水洗涤并冷冻干燥后得到UIO-66@MIPs. 非印迹材料(UIO-66@NIPs)的制备过程采用与UIO-66@MIPs相似的流程，但不添加模板蛋白Ig G.

1.4 UIO-66@MIPs的吸附性能研究

1.4.1 吸附等温实验

吸附等温实验用来研究UIO-66@MIPs和UIO-66@NIPs对Ig G的饱和吸附量以及印迹效果. 具体流程如下：将10 mg的吸附材料在25 ℃下至于20 mL不同Ig G初始浓度的磷酸缓冲溶液(0.01 mol/L，pH=7)中，恒温振荡50 min. 随后，利用高速离心机将吸附材料从溶液中进行分离，并采用紫外分光光度法(280 nm)对其浓度进行检测. 其吸附量可以通过Q = (c₀ - c_e)V/m来计算. 其中c₀(mg/mL)和c_e (mg/mL)分别是Ig G溶液的初始和吸附后的浓度，V (mL)是溶液的体积，而m(g)为吸附剂的质量. 印迹因子(IF)来衡量MIPs对模板蛋白质识别能力，其公式为IF = Q_MIPs/Q_NIPs. 其中Q_MIPs和Q_NIPs分别是印迹和非印迹材料对Ig G的吸附量.

1.4.2 吸附动力学实验

吸附动力学实验用来研究印迹和非印迹材料的吸附平衡时间. 具体流程如下：将10 mg的吸附材料在25 ℃下置于20 mL、浓度为2.0 mg/mL Ig G的磷酸缓冲溶液(0.01 mol/L，pH=7)中. 采用上述相同的检测方法，确定吸附材料在不同吸附时间对Ig G的吸附量.

1.4.3 选择性吸附实验

选择性吸附实验用来研究UIO-66@MIPs对不同蛋白的选择性. 具体流程如下：将10 mg的吸附材料在25 ℃下置于20 mL、含浓度为2.0 mg/mL Ig G或参比蛋白的磷酸缓冲溶液(0.01 mol/L，pH=7)中. 采用与上述相同的检测方法，确定吸附材料在不同吸附时间内对蛋白的吸附量. 利用选择性因子(β)来衡量材料对蛋白的吸附选择性，其公式为，β = IF_temp/IF_ana，其中IF_temp和IF_ana分别是印迹材料对模板蛋白和参比蛋白的印迹因子.

1.4.4 竞争吸附实验

竞争吸附实验来研究UIO-66@MIPs和UIO-66@NIPs对Ig G的特异性识别作用. 具体流程如下：将10 mg的印迹或非印迹材料置于10 mL分别含有2 mg/mL Ig G和HSA的磷酸缓冲溶液(0.01 mol/L，pH=7)中. 随后在25 ℃下恒温振荡50 min，并利用高速离心机将吸附材料从溶液中进行分离. 将分离后的材料在室温下采用0.5 mol/L的NaCl溶液和乙酸溶液(6.0 vt％)交替洗涤，直至洗脱液无法在紫外分光光度计中检测到蛋白特征峰强度(280 nm). 收集合并洗脱液，并利用截留分子量量为1000的透析袋进行透析，并冷冻干燥产物. 随后将冻干产物溶解在2 mL的磷酸缓冲溶液(0.01 mol/L，pH=7)中，并采用SDS-PAGE进行检测. SDS-PAGE中分离胶和浓缩胶浓度分别为10%的和5%.

1.4.5 统计分析

对于吸附等温实验、吸附动力学实验、选择性吸附实验以及SBMA用量对吸附性能影响实验，这些吸附量数据均以平均值±标准偏差来表示，每个实验条件重复2次. 使用单向方差分析和随后的Tukey检验进行统计分析. 当p值小于0.05时，2组之间的差异被认为是显著的.

2 结果与讨论

2.1 UIO-66@MIPs的设计

本文以UIO-66为载体，AM、AAm和两性离子单体SBMA作为功能单体组，MBA作为交联剂，通过表面印迹技术结合蛋白固定化策略的方法，用于构筑高性能Ig G印迹材料(UIO-66@MIPs)，如图1所示. 由于UIO-66材料自身极高的比表面积、表面丰富的氨基官能团、苯环结构以及不饱和的锆离子，应能够通过氢键、静电、π-π堆叠等作用，对Ig G产生优异的固载量. 因而，由大量负载Ig G的MOF而制备的聚合物材料，在Ig G洗脱后，将形成众多的、与模板蛋白在形状、大小以及官能团相互匹配的印迹孔穴，最终有利于MIPs在吸附量和识别性的高性能表现. 此外，将两性离子单体(SBMA)引入到印迹层的构筑过程中，理论上能有效减少印迹材料对蛋白质的非特异性吸附.

Fig. 1 Schematic illustration of the preparation of UIO-66@MIPs.

2.2 UIO-66@MIPs的化学结构表征

通过FTIR表征了所制备材料的化学结构，结果如图2(a)所示. 在原始UIO-66的谱图中，位于3452，3345，1255和766 cm^-1的峰分别对应于UIO-66中氨基(―NH₂)的对称和反对称伸缩振动，碳氮键(C_ar―N)伸缩振动以及N－H的摆动振动^[15]. 而在1669和1504 cm^-1位置处的特征峰为羰基的不对称和对称伸缩振动. 与原始UIO-66相比，UIO-66-MA光谱图在1664 cm^-1处的峰强度明显增强，这应该是甲基丙烯酸酐改性所引起的^[16]. 此外，UIO-66@MIPs的红外光谱图除了具备上述特征峰之外，在1042 cm^-1处出现了新的特征峰，它对应于两性离子官能团中SO₃^-的伸缩振动^[17].

Fig. 2 FTIR spectra (a), XPS spectra (b), TGA curves (c) and XRD patterns (d) of UIO-66, UIO-66-MA, and UIO-66@MIPs.

采用XPS来表征所制备材料的元素组成，结果显示于图2(b). 可以发现，原始UIO-66和UIO-66-MA在398.54 eV和182.38，329.56，343.22，429.92 eV位置处，分别为N元素和Zr元素的结合能^[18]. 在UIO-66-MA表面进行聚合后，UIO-66@MIPs在167.81 eV处出现了S元素的特征峰，证明了两性离子官能团的存在. 此外，从TGA分析结果(图2(c))也可以发现，印迹材料比UIO-66和UIO-66-MA在100~600 ℃范围内具有更大的热失重，这应该是上述材料表面含有聚合物层的原因所致. 另外，XRD分析结果(图2(d))也表明UIO-66@MIPs在2θ=7.34°，8.48°处，存在与UIO-66和UIO-66-MA晶体一致的特征峰^[18]. 因而，上述表征的综合结果可以说明UIO-66@MIPs已被成功制备.

2.3 UIO-66@MIPs的形貌和物理性质表征

SEM和DLS分别用于材料的形貌和粒径的表征. 如图3(a)和3(b)所示，UIO-66和UIO-66-MA晶体呈现出规则的正八面体形状，并且结合图4(a)中DLS结果发现，它们的平均粒径尺寸为143和138 nm. 此外，不论从SEM图还是DLS图结果都说明，UIO-66和UIO-66-MA具有极好的单分散性. 与之相比，UIO-66@MIPs和UIO-66@NIPs的SEM图(图3(c)和3(d))显示出UIO-66被新的物质包覆，并且材料显示出明显的团聚现象. 这一现象也与DLS结果(图4(a))一致. 这可能是UIO-66极大的比表面积和极高的表面能，使其在后续印迹过程中发生了严重的团聚现象所致.

Fig. 3 SEM images of UIO-66 (a), UIO-66-MA (b), UIO-66@MIPs (c) and UIO-66@NIPs (d).

Fig. 4 DLS (a) and N₂ adsorption-desorption isotherms (b) of UIO-66,UIO-66-MA, UIO-66@MIPs and UIO-66@NIPs.

为了进一步研究所制备材料的孔结构和比表面积，所制备的材料用于氮气吸附-脱附等温实验，结果如图4(b)和表1所示. 从图中可以发现，含UIO-66晶体的4种材料都呈现出典型的I型吸附脱附等温曲线，说明了它们含有微孔结构^[19].

Table 1 Properties of synthetic materials.

Material	Specific surface area (BET ^a) (m²/g)	Average pore size (nm)	Pore volume (cm³/g)
UIO-66	648.3	2.132	0.344
UIO-66-MA	627.9	2.118	0.328
UIO-66@MIPs	362.5	2.809	0.267
UIO-66@NIPs	357.9	2.984	0.251

^a Brunauer-Emmett-Teller method.

此外，相应BET、平均孔径和孔隙体积数据如表1所示，原始UIO-66和UIO-66-MA能够显示出优异的比表面积648.3和627.9 m²/g，并且它们的平均孔径为2.132和2.118 nm，说明lg G蛋白与UIO-66晶体的结合应该发生在材料表面. 此外，UIO-66@MIPs和UIO-66@NIPs的比表面积和孔体积与UIO-66和UIO-66-MA相比明显降低，这也与上述SEM表征结果相符. 尽管这样，印迹和非印迹材料的比表面积依然达到较高的362.5和357.9 m²/g，这对于它们高效分离目标蛋白具有积极作用.

2.4 两性离子单体用量对UIO-66@MIPs识别性的影响

本文将两性离子单体SBMA用于MIPs的制备，以降低该材料对蛋白的非特异性结合. 因此，SBMA用量对UIO-66@MIPs吸附量和识别性的影响被进一步探究. 如图5所示，不加入SBMA的MIPs对Ig G的吸附量可达到306.9 mg/g，明显优于之前报道的Ig G印迹冻胶55.1和106.1 mg/g的最大吸附量^[20,21]. 这应该归因于UIO-66载体极大的比表面积，使得所制备的UIO-66@MIPs具有更多的作用位点所致. 然而，在不加入SBMA的情况下，UIO-66@NIPs亦能对Ig G产生较大的吸附量，因而，该制备条件下的UIO-66@MIPs印迹因子只有1.63. 随着SBMA用量的增加，MIPs和NIPs的吸附量逐渐降低，这应该是由于两性离子官能团的存在可以通过溶剂化作用和氢键形成水壳层，因此减弱了吸附剂与蛋白之间的相互作用. 此外，可以发现随着SBMA用量的增加，所制备MIPs的识别性出现先增加后降低的现象. 这可能是因为当蛋白“惰性”作用单体SBMA用量较低时，它不能像其他功能单体一样通过静电、氢键等作用与模板蛋白进行结合. 因而，MIPs中的两性离子基团主要分布在印迹孔穴之外的材料区域，降低了其对蛋白的非特异性吸附，提高了识别性^[12,13]. 进一步增加SBMA用量，可能导致它会同时参与到印迹孔穴和孔穴之外的区域构筑，因此降低印迹孔穴对模板蛋白的结合，最终可能会减弱UIO-66@MIPs的识别能力^[22,23]. 为了获得最佳的识别性，占功能单体总质量20%的SBMA用量成为制备UIO-66@MIPs的最优条件.

Fig. 5 Effect of SBMA dosage on adsorption capacity and recognition of UIO-66@MIPs. The concentration of Ig G is 2.0 mg/mL, and adsorption time is 50 min. Significance: ns ≡ not significant (p≥0.05), * ≡ significant (p<0.05).

2.5 UIO-66@MIPs吸附性能表征

吸附动力学实验用来研究吸附时间对MIPs和NIPs吸附性能的影响. 如图6(a)所示，在初始40 min内，UIO-66@MIPs 对2.0 mg/mLIg G溶液的吸附量明显高于UIO-66@NIPs，说明UIO-66@MIPs与Ig G之间作用力更强. 这应该是印迹材料中形成了与模板分子在形状和大小相互匹配的印迹孔穴所致. 在吸附40 min后，UIO-66@MIPs和UIO-66@NIPs的吸附速率逐渐降低，最终在50 min左右达到吸附平衡. UIO-66@MIPs较快的吸附平衡时间可能是由于本工作中采用了表面印迹技术，降低了蛋白在聚合物层的传质阻力所致. 因此，本文后续的吸附实验采用50 min作为最佳吸附实验条件.

Fig. 6 Adsorption kinetics (a) and isotherm curves (b) of UIO-66@MIPs and UIO-66@NIPs. Significance: ns ≡ not significant (p≥0.05), * ≡ significant (p<0.05).

吸附等温实验用来研究UIO-66@MIPs和UIO-66@NIPs的吸附量随Ig G初始浓度变化的影响. 如图6(b)所示，2种材料的吸附量随着蛋白浓度的增加而增大. 并且UIO-66@MIPs和UIO-66@NIPs分别在1.5和2.0 mg/mL分别达到饱和吸附. 此外，UIO-66@MIPs的饱和吸附量(217.4 mg/g)明显高于UIO-66@NIPs的值(87.6 mg/g)，印迹因子IF可达2.48. 这进一步证明UIO-66@MIPs中存在对Ig G具有识别作用的印迹孔穴. 因此，为了更好地对比印迹和非印迹材料，如无特殊说明，本工作中后续吸附实验的Ig G浓度选为2.0 mg/mL.

为了研究上述MIPs和NIPs对Ig G的吸附机理，本工作分别采用Langmuir吸附模型和Freundlich吸附模型对吸附等温曲线进行拟合. Langmuir吸附模型描述的是在吸附剂表面形成饱和单分子层的过程，而Freundlich吸附模型通常用于模拟非均相吸附剂表面的吸附现象. Langmuir吸附模型公式为c_e/Q_e = 1/K_LQ_m + c_e/Q_m，K_L是亲合常数，而是Q_m理论最大吸附量. Freundlich吸附模型公式为InQ_e = InK_f + (1/n)InC_e，K_f和1/n分别是与Freundlich模型拟合相关的吸附量和吸附强度. 拟合结果如表2所示. 可以发现，印迹和非印迹材料对Langmuir吸附模型拟合的R²均大于Freundlich吸附模型，说明UIO-66@MIPs和UIO-66@NIPs对Ig G的吸附行为应是以单分子层吸附为主. 此外，可以看到UIO-66@MIPs对Ig G的亲合常数K_L与理论最大吸附量Q_m都明显高于UIO-66@NIPs，这进一步证明印迹材料中存在众多的、能够与Ig G相互匹配的印迹孔穴，能够实现它对模板蛋白的吸附识别.

Table 2 Theoretical adsorption constant from the Langmuir and Freundlich model.

Sample	Langmuir model			Freundlich model
Sample	K_L (mL/mg)	Q_m (mg/g)	R²	K_F (L/mg)	n^-1	R²
UIO-66@MIPs	1.43	333.3	0.984	195.9	0.645	0.971
UIO-66@NIPs	0.81	144.9	0.993	61.9	0.729	0.980

2.6 UIO-66@MIPs的选择吸附性能研究

UIO-66@MIPs的选择吸附性能可以通过它们对模板蛋白和参比蛋白的比较来获得. 本文以不同分子量和等电点的HRP (M_w= 40 kDa，pI=7.2)，OVA (M_w= 45 kDa，pI=4.7)，HSA (M_w= 66 kDa，pI=4.8)和Cyt C (M_w= 10.5 kDa，pI=12.5)分别作为参比蛋白. 如图7所示，UIO-66@MIPs对模板蛋白Ig G的印迹因子IF值远高于对其他蛋白，再次说明了MIPs中存在与Ig G大小和官能团相互匹配的印迹孔穴. 此外，与其他参比蛋白相比，印迹材料和非印迹材料具有对Cyt C更高的吸附量，这可能是由于其较小的分子体积以及较高的等电点pI，使其能够较为容易地与UIO-66@MIPs表面和印迹孔穴中的羧基官能团产生作用. 即使这样，UIO-66@MIPs对Cyt C的选择性因子β依然大于2.3，说明其具有优异的蛋白选择性.

Fig. 7 Selective adsorption experiment of UIO-66@MIPs and UIO-66@NIPs. Significance: ns ≡ not significant (p≥0.05), * ≡ significant (p<0.05).

2.7 UIO-66@MIPs的竞争吸附性能研究

UIO-66@MIPs的特异识别性采用SDS-PAGE来检测. 如图8所示，第2列条带痕迹为含有2 mg/mL的HSA和Ig G混合蛋白溶液，第3和第4列条带分别为从UIO-66@MIPs和UIO-66@NIPs中洗脱的蛋白. 可以发现，从第3列UIO-66@MIPs中洗脱的蛋白，在150 kDa处的痕迹颜色明显比第4列条带中UIO-66@NIPs相同位置处的痕迹深，同时UIO-66@MIPs在66 kDa处的蛋白痕迹又浅于UIO-66@NIPs. 说明与非印迹材料相比，所制备的印迹材料能够在蛋白混合溶液中更好地识别和分离Ig G蛋白. 这也证明了本文所制备UIO-66@MIPs可应用于含Ig G样本实际检测和分离的良好潜力.

Fig. 8 SDS-PAGE analysis of competitive adsorption of UIO-66@MIPs and UIO-66@NIPs. (Lane 1, protein molecular weight marker; Lane 2, the mixture solution of Ig G and HSA with each concentration of 2.0 mg/mL; Lane 3, the protein eluted from UIO-66@MIPs; Lane 4, the protein eluted from UIO-66@NIPs).

3 结论

本文以金属有机框架材料UIO-66作为载体，两性离子单体SBMA作为功能单体，利用模板固定化结合表面印迹技术的策略，成功制备了新型的Ig G印迹材料. 研究结果表明，UIO-66载体的使用赋予了印迹材料对蛋白极大的吸附量. 而SBMA的加入可以有效地降低UIO-66@MIPs对蛋白的非特异性吸附，因而增强了其识别性. 最终，所制备的UIO-66@MIPs能够从蛋白混合溶液中有效提取模板蛋白Ig G，证明了在人体血清检测装置中潜在的应用能力和价值.

关键字：优秀论文

上一篇：超声辅助制备超疏水聚丙烯表面花瓣状微纳结构
下一篇：基于金属配位作用制备高性能聚酰亚胺

栏目分类

热门排行

推荐信息

期刊知识