基于数字微镜器件的高时空分辨选择性光刺激系统

达曼光栅是一种能够使入射光在其远场傅里叶变换面高效地转换成均匀光强点阵的二值相位光栅，主要分为奇数型达曼光栅和偶数型达曼光栅^［21-23］。系统采用的达曼光栅结构为2×2的偶数型结构，选择其频谱面4个一级衍射光中的一个作为扫描点，通过改变达曼光栅的转折点位置和周期来控制-1级和0级衍射之间的分离距离（或角度），实现二维方向的选择性逐点扫描。其中每一张达曼光栅图对应一个扫描点，将结构变化的达曼光栅加载到DMD上，实现基于DMD的选择性逐点扫描。由达曼光栅原理以及光栅方程可知，一级衍射光位置为

式中，f为达曼光栅后透镜的焦距，λ为光源波长，d_Damm为光栅周期，θ 为各个分数级次的发散角。当透镜焦距、光源波长固定时，可通过更换光栅周期实现一级衍射光位置的变化。系统中二维方向上选择性逐点扫描的实现的基本流程是：通过计算机获取感兴趣区域对应的位置信息，由计算全息的方法生成感兴趣位置对应的达曼光栅结构，并通过计算机编码来制作不同的全息图，最后通过DMD实现对目标区域的选择性逐点光刺激。

基于DMD的时空分辨率选择性逐点光刺激系统原理如图1（f）所示，卤素灯光源通过650/40 nm带通滤光片发出红光，在加入环形光照明装置后进行环形光照明以实现暗场成像。该高时空分辨率选择性点刺激系统生成扫描点的流程如图1（a），由LabView完成同步控制及用户界面显示。计算机首先将sCMOS相机获取的暗场成像进行阈值处理后，计算机生成并储存值为1的像素坐标，用于计算需要加载在DMD上的达曼光栅相位图。由于DMD的工作特性，准直后的473 nm的激光以24°入射在DMD芯片表面。DMD位于傅里叶变换透镜（f=200 mm）的前焦面，其加载的达曼光栅在透镜后焦面产生衍射光斑，然后将孔径可调的方形光阑置于该傅里叶面，滤除零级斑及其余衍射斑，仅保留一个1级衍射斑作为扫描刺激点（图1（f））。后置的管镜（f=200 mm）与显微物镜（M=20×）组成4f系统，将上述扫描点共轭成像到样品面上用于扫描光刺激，实验证明光刺激的扫描视场最大可达400 μm×400 μm，扫描速度取决于DMD的更新速度，最大可达10 kHz。

图1  基于DMD的高时空分辨率逐点光刺激系统的实现原理

Fig. 1  The principle of selective optical stimulation system with high spatiotemporal resolution based on DMD

系统中，经DMD调制的光束在成像面扫描视场的大小可通过改变光栅周期f_x，扫描透镜焦距f_scan，套筒透镜焦距f_tube，及物镜的焦距f_obj来控制。在x轴方向的最大扫描视场可以表示为

式中，∆θ为调制光束通过DMD后的一阶衍射角，f_scan为扫描透镜焦距，f_obj为物镜焦距，f_tube为套筒透镜焦距，f_x为光栅的空间频率且fx=1NTx×d， NTx为在x轴方向上每个光栅周期内所占的DMD像素数，d为DMD像素点的尺寸7.6 μm，由于DMD入射角度为45°，因此实际有效的d的大小为10.75 μm。NTx,min为x轴方向上每个光栅周期内所占的DMD像素数的最少数，实际上DMD上相邻像素点一个为“开态”，一个为“关态”，此时每个光栅周期内所占DMD像素点数最少，即2个像素点；NTx,max为x轴方向上每个光栅周期内所占的DMD的最大像素数，默认为∞。y轴方向的最大扫描视场与x轴方向相同。假设扫描透镜焦距f_scan=200 mm，套筒透镜焦距f_tube=200 mm，物镜焦距f_obj=10 mm，波长λ=473 nm，基于DMD的选择性扫描系统的最大扫描视场为220 μm。

基于DMD的选择性扫描系统最小扫描间隔由光斑内所占DMD像素数等参数表示，即

式中，∆f_x，min为最小空间频率变化，Δfx,min=1nNTxd，n为光斑内所占DMD的像素数，这里取n=1 080，NTx,min=2，计算出最小步长为0.204 μm。

为了能够对感兴趣区域进行精准光刺激，需要使滤波后的调制光衍射面和显微成像系统视场空间匹配，通过探测器可以实现任意选择空间光刺激模式以满足实际需求。图2表示在进行刺激视场与成像视场的空间匹配前，通过相机获得的成像视场与刺激光场的空间关系，白色区域代表成像视场，红色虚线范围为扫描视场，两者在空间尺寸，空间位置及角度上均不匹配。

图2  成像视场和扫描视场的空间不匹配示意图

Fig. 2  Schematic diagram of the spatial mismatch between the imaging field of view and the scanning field of view.

当光路确定后，成像视场的大小和位置也确定了，通过改变扫描光路中一些参数来进行视场匹配。首先确定系统的成像视场大小为400 μm×400 μm，在向程序输入ROI坐标以及尺寸参数后，通过图像处理可获对应的全息图，使用DMD加载全息图并在物镜后得到图2红色虚线中的目标光场。为了使扫描视场也为400 μm×400 μm，将扫描透镜大小更换为300 μm ，套筒透镜大小更换为100 μm，并改变操作数x_d，实现400 μm×400 μm 的扫描视场。成像视场大小和扫描视场大小尺寸匹配后，还需使成像视场中心和扫描视场中心重合。在刺激光场经过套筒透镜ftube后和进入物镜前，通过一组双反射镜来准直ftube后的出射光。最后调节相机靶面偏转角，使扫描视场和成像视场完全共定位。

系统中所有的操作由自定义开发的LabVIEW程序完成。系统的暗场成像主要通过LabVIEW实时改变成像时相机的参数，显示成像结果及对图像进行保存等。包括改变相机在成像时的分辨率、曝光时间、对比度等，以及保存图片的格式、路径等等。用于图像处理及生成全息图的MATLAB脚本可嵌入LabVIEW程序中，实现对图像的像素化处理，边缘检测/阈值处理，ROI坐标信息转化和全息图生成。LabVIEW 还可控制电动旋转色轮进行自动滤光片切换，以及控制DMD加载全息图的时序，实现对ROI的选择性逐点光刺激。

图像处理由MATLAB实现，为了获取ROI坐标，首先对图像进行不同程度的像素化处理，一定程度的像素缩放在不影响还原度的情况下减少ROI的像素点，极大地提高了系统对视场内目标区域的扫描速度。然后对像素化处理后的图像进行二值化处理或边缘检测，最后获取图像处理后ROI的坐标。

使用MATLAB生成偶数型二维达曼光栅图，并将其作为全息图加载到DMD上以得到扫描光斑。偶数点阵达曼光栅结构排除了零级衍射光对制作误差的敏感性，照明均匀性好于奇数阵列照明。在生成全息图时，算法采用了周常河求解2×2偶数型达曼光栅时的最优数值解0.5^［24］。为了在扫描透镜后焦面产生沿x和y轴方向扫描的点，需要通过改变物光场x轴和y轴的相对坐标值（分别表示为x_d和y_d），从而改变-1级和0级衍射光斑之间的分离距离（或角度）来实现。实验中应避免选择过高的x_d或y_d，因为它们会导致不同级次的衍射光束重叠。

由于DMD上的反射镜只有“0”和“1”两种状态，只能加载二值全息图，因此需要对获得的相位型光栅进行二值化处理，以获得“0”“1”结构的数字光栅^［25］。通过以上步骤获得的达曼光栅是一个二维的方形矩阵，而DMD上的像素点数是1 920×1 080，为充分利用DMD像素点数并且使达曼光栅以正常状态加载到DMD（若加载到DMD上的图片像素点数不是1 920×1 080，DMD会对图片进行默认缩放）上，在制作达曼光栅时选择的像素点数为1 080×1 080，并在其两边分别加上1 080×420“关态”矩阵，最终生成的DMD上加载的达曼光栅结构如图3。

图3  加载到DMD上的全息图

Fig. 3  The Hologram loaded on DMD

实验使用罗丹明A指示剂，对扫描路径进行成像，将电动旋转色轮内的滤光片切换为495 nm长通滤光片。获得的扫描视场大小为400 μm×400 μm（图4（a））。使用光束质量分析仪对单个扫描点的光强进行测量，并对光强采样值进行高斯拟合，获得的单个扫描点的光强峰值半高全宽对应于相机的4个像素点，每个像素点在实际视场中对应的尺寸为0.325 μm，因此单个光斑的峰值半高宽为1.5 μm。使用不同焦距的扫描透镜，套筒透镜以及物镜可以获得不同范围的扫描视场。

图4  光刺激系统获得最大扫描视场以及单个光斑的分辨率

Fig. 4  The maximum scanning field of view obtained by the optical stimulation system and the intensity Gaussian fitting curve of single stimulus spot

为验证系统对复杂图案的选择性逐点光刺激能力，将深圳大学校徽进行像素化与阈值化处理，坐标获取后，将其转换所得的全息图序列依次加载到DMD上（图7（c）），设置单个扫描点的驻留时间与相机曝光时间分别设置为100 μs和1 s，以获取所有光刺激点在曝光时间内的组合图，获得的扫描结果如图7（d）。将电动旋转色轮内的滤光片切换为525 nm长通滤光片，以相同的步骤在10倍物镜下，对被荧光素钠染色的卵巢癌细胞进行了复杂图案的跨细胞扫描，结果如图7（e），可以看出在被均匀染色的细胞密集的区域能够成功激发出目标图案。

图7  复杂图案的DMD扫描流程

Fig.7  Scanning schematic of complex pattern with DMD