集成纳米增强基底的微流控SERS芯片及其致病菌检测

作者：李世芳何红葛闯陈李徐溢来源：《光学精密工程》日期：2022-09-21人气：3266

快速、高效、准确地对致病菌进行鉴别和检测在医学诊断、食品安全、公共卫生等多个方面都具有重要意义。以临床细菌感染为例，严重的致病菌感染死亡率高达35%~70%，对人类健康造成极大的威胁。目前，致病菌检测多采用传统的培养与镜检、分子生物学检测法或免疫学检测法等^［1-2］。培养与镜检等传统检测方法的优势在于操作简单，但通常需要1~3天才能得到相应的结果；分子生物学检测法如聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction， PCR）虽然缩短了检测时间，且具有检测灵敏度高，特异性好等优点，但其操作繁琐，成本较高，同时需要熟练的操作技能；以抗原抗体为基础的免疫学检测法如酶联免疫分析，虽然具有特异性好、敏感性高，检测速度快，费用低等优点，但是存在操作复杂、容易受污染、蛋白不稳定等缺点，同时检测易受抗原、抗体相结合能力的影响，易造成假阳性。以上这些检测方法都存在一定局限性并大大限制了其在临床快速诊断中的广泛应用^［3］。因此，发展针对微量致病菌的快速、高灵敏度、高选择性的辨识检测新方法备受关注。

拉曼光谱是一种基于物质分子振动而获得物质指纹光谱的分析技术，具有能带谱窄、检测所需样本少、不受水的干扰等特点^［4］，是一种良好的生化样本检测技术。但拉曼光谱的散射截面非常小，其散射光强度约为入射光强度的10^-¹⁰，导致信号极弱，因此拉曼光谱很难检测低浓度的样品分子^［5］。伴随着纳米技术的迅猛发展，基于纳米微结构产生的电磁场增强和化学增强效应可将分子拉曼信号增强10⁶~10¹⁴倍^［6］，甚至具有单分子探测能力，即表面增强拉曼散射（Surface Enhanced Raman Scattering，SERS）光谱。当前，SERS光谱分析方法正成为一种备受关注的生化检测手段^［7］。

微流控芯片分析技术可将样品分离、富集、混合、衍生、反应和检测等多种功能模块集中到一个微芯片上，在宽度/深度为微米的管道中操作流体，具有样品消耗少、反应时间短、使用方便、产品转化率高且产生废弃物少等优势^［8］，在细菌、真菌和细胞等研究中展现出极大的优势和潜力^［9］。近年来，人们发现在微流控芯片上集成SERS分析模块从而实现微流控芯片分析平台与SERS光谱分析技术的有机结合，能够有效解决生化样品分析中SERS检测灵敏度低、信号重现性差及样本在敞开体系中易被污染等问题，并能实现仅在微升甚至纳升的生化液体中靶标物的快速灵敏检测。此外，微流控芯片还能高度模拟细菌的培养条件和生活环境，同时实施细菌的分选、培养和分离等预处理操作，并结合SERS检测技术实现对细菌的高灵敏度无损探测，获取更多细菌的拉曼光谱信息。

据此，针对生化样本中致病菌的高效检测需求，本文在介绍SERS光谱及其增强介质材料和结构的基础之上，结合微流控芯片分析技术对芯片上集成SERS活性基底结构的方法进行了探讨，包括在芯片微通道中注入金属溶胶颗粒、在微流控芯片检测区构建固体纳米结构以及在微通道中原位制备纳米增强基底等进行详细论述；重点综述了基于微流控SERS芯片的致病菌检测方法及其应用，以期对生化样本中致病菌的高效检测提供有借鉴意义的新方法和新途径。

2 微流控芯片上SERS增强基底的构建

2.1　SERS增强机理

SERS增强机理主要分为电磁场增强（Electromagnetic Enhancement， EM）和化学增强（Chemical Enhancement， CE）^［10］。电磁场增强是由于金属纳米结构上局域表面等离子体共振（Localized Surface Plasma Resonance， LSPR）的形成^［11］。化学增强则是由于化学吸附作用、吸附物与基底之间的光子驱动电荷转移以及电子-空穴对与被吸附分子之间的耦合作用^［12］。

SERS光谱强度I_SERS可以通过以下公式表示^［13］：

（1）

（2）

其中：G_EM为EM的增强因子，A（ν_S）和A（ν_L）分别是拉曼散射场的增强因子和激光的增强因子，ε₀为周围介质的介电常数，ε_ν代表金属纳米结构的介电常数，r代表金属纳米结构的基本单元（如小球）的半径，d为被分析物与金属纳米结构之间的距离，和项（α_ρσ）_nm为CE的增强因子，描述了分子与金属表面的相互作用。从式（2）可以看出电磁场增强因子G_EM近似与金属纳米结构所产生的局域电场强度4次方成正比。更重要的是，纳米微结构周围的电磁场并非均匀分布，而是高度局域于空间狭窄区域，如在尖端、间隙处会产生更大的电磁场增强^［14］。

2.2　SERS增强基底材料

优异的SERS活性基底是获得生化样本良好拉曼增强信号的前提条件，而纳米技术的发展为SERS 活性基底的研发和拓展提供了广阔的空间。大量的研究显示，纳米材料的种类、纳米颗粒的形貌和尺寸以及检测分子与纳米结构之间的相互作用模式等因素都会影响SERS的增强效果^［15-16］。因此，构建具有良好信号放大效果的SERS基底是拉曼光谱技术应用于生化检测的重要环节。

随着纳米合成技术的发展，多种材料已经被用于制备SERS基底。基于金银纳米颗粒溶胶的SERS基底是目前最常见且应用最成熟的，这是因为金银纳米颗粒具有良好的SERS增强效果且制备简单^［17］。但是这些基底在实际运用中依然存在一些局限性，比如Au、Ag等贵金属基底价格昂贵、在空气中容易被氧化、功能单一、纳米溶胶的分散性以及基底的有效性会随着时间的增加而降低等。为此，人们提出采用复合纳米材料及其纳米微结构作为SERS增强基底，如：贵金属复合材料、半导体复合材料、石墨烯纳米复合材料以及磁性纳米材料等，涉及SERS的纳米复合材料一直是人们关注和研发的热点，已有很多研究及相关综述^［18-19］。表1对这类纳米材料的类型、特点进行了归纳和比较。

表1 基于复合纳米材料的SERS增强基底

Tab.1 SERS enhanced substrate based on composite nanomaterials

SERS基底材料种类	特点	举例
贵金属纳米材料^［20］	制备简单但选择性、重现性、稳定性差	Ag、Au、Cu、
复合贵金属纳米材料^［21-23］	稳定性好、良好的生物相容性	Au@Ag、Ag@Au、Au@Pt
磁性纳米材料^［24-26］	利用磁性可实现检测物的检测分离富集，提高SERS检测灵敏度、简化复杂样品预处理	Fe₃O₄/Ag、Fe₃O₄@Au、 Ni/Au、Ni/Ag
半导体复合材料^［27^-^29］	SERS化学增强、光电催化特性	Ag/TiO₂、Ag/ZnO、Ag/CuO、Si/Au
石墨烯纳米复合材料^［30^-^31］	表面积大、光学特性好、易进行功能化改性、导电性好、荧光背景信号低	CNTs/Ag NPs、GO/Ag

可以看到，双金属材料的复合，在等离子共振吸收调控方面具有无可比拟的优势，通过双金属的复合能极大地提高SERS增强效果。半导体与金属的掺杂，可提高基底的化学增强效应，并拓展SERS复合基底的催化效能，甚至可使基底具有自清洁效应。磁性纳米复合材料通过外加磁场使携带有目标物的磁性纳米颗粒产生定向的磁力作用，可实现对待测物的高效分离富集，极大地简化复杂基质样品前处理过程并增强待测物组分的SERS光谱信号，有效提高检测灵敏度。石墨烯纳米复合材料能改善金属基底的吸附效能，降低荧光背景，其具备电磁增强与化学增强的协同作用，可进一步提高SERS基底的增强效应。

2.3　微流控芯片上SERS增强基底的集成制备

微流控SERS芯片的核心是将纳米增强基底微结构与微流体通道有机融合，所采用的纳米增强材料、纳米颗粒的形貌、纳米结构的尺寸和间距等都是决定着微流控SESR芯片检测效率的关键因素。用微流控芯片取代传统的样品载体进行SERS检测，具有操作连续一体化、样品消耗少、环境可控且适于生化样本等优点。

2.3.1　基于待测物与纳米溶胶混合的微流控SERS芯片

将纳米金属溶胶通过外部注入的方式引入微流控芯片，使其与待测物进行有效混合，进而实现SERS光谱检测。这种外部注入模式操作简单方便，但是其灵敏度和重复性很大程度上依赖于被分析对象和金属纳米粒子间的有效接触和混合。按照有无外界能量驱动的方式，芯片微通道中的混合过程可分为被动混合和主动混合两种。

被动混合式芯片通过合理设计流体通道的内部结构和几何特性，改变流体的流动方式，增大混合面积来提高混合效率，具有操作简单灵活的特性。Lee等^［32］研制的锯齿形聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控通道，如图1（a），可用于高效混合孔雀石绿（MG）和Ag NPs，基于SERS对水中MG进行检测的检出限低至12×10^-¹² mg/L。Yea等^［33］在含有类似鳄鱼齿形的PDMS微流体通道内，使用SERS光谱技术对水体污染物中的氰化物进行检测，检测灵敏度达到0.5×10^-⁴ mg/L水平，如图1（b）。

图1 集成混合微通道的微流控SERS芯片示意图^{［32-33，35-36］}

Fig.1 Microfluidic SERS chip integrated with mixed microchannels^{［32-33，35-36］}

主动混合式芯片则是通过外力（包括电场、磁场、蠕动泵等）的作用在通道内使液体间产生相互运动来达到混合的效果^［34］。虽然主动混合的混合效果优于被动混合，但是主动混合式芯片的制备更加复杂，因此根据需求选择合理的混合方式是非常有必要的。

液滴微流体芯片为改善颗粒混合性能提供了新的途径，待测样本在液滴内发生对流流动，可以直接促进其与纳米胶体溶液的混合，避免纳米粒子在连续流动状态下沉积聚集，以及在微通道壁上造成的 “记忆效应”等对测定结果产生干扰。Hidi等^［35］研制的液滴SERS微流控芯片（图1（c））被用于检测人体尿样中的硝基唑啉（NTX），其检出限为0.57 mg/L，线性范围为0.81~8.13 mg/L。该平台不仅实现了高通量的多路检测，而且避免了样品的交叉污染。Gao等^［36］在如图1（d）所示的液滴微流控芯片上利用SERS光谱技术对血清中前列腺特异性抗原（PSA）进行了检测，其检出限低至10^-⁴ mg/L。

采用外部注入纳米溶胶与待测组分在微流控芯片的微通道中混合的方式，可以实现对待测物拉曼信号的有效增强，但同时也存在混合均匀性难以控制、耗时较长、样品难分离、通道堵塞以及纳米溶胶随机聚集等问题，这会导致SERS光谱信号的稳定性和重现性较差，不利于生化样本的高效检测^［37］。因此，在固体表面基板上设计固定有序的微纳米结构，用于制备微流控SERS芯片引起了人们的关注。

2.3.2　基于微通道中固定有序纳米基底的微流控SERS芯片

近年来，在微流控芯片的微通道或微腔室中集成SERS增强纳米基底的研究备受关注。由于固定纳米基底的有序结构，其信号稳定性和重现性比基于混合模式的纳米溶胶的SERS增强效应更好。目前用于制备固定有序纳米增强SERS基底的方法较多，包括：电化学沉积法、电子束光刻法、溅射法、自组装法等。我们课题组^［38-40］在微流控芯片上制作了多种有序纳米结构的SERS增强基底，其中采用电化学沉积法制备的ITO-rGO/Ag和Ag-Au增强基底，分别对罗丹明6G和4-巯基苯甲酸进行了SERS检测，最低检出限分别为10^-¹¹ mol/L和10^-¹⁰ mol/L。Chen等^［41］以超薄阳极氧化铝（AAO）薄膜为模板，在石英玻璃片上沉积有序Ag纳米点阵作为增强基底，如图2（a），检测了浓度为5.0×10^-⁷ mol/L的腺嘌呤和福美双。Viehrig等^［42］使用离子蚀刻技术，在硅片上制备纳米柱，通过电子束光刻法在柱上形成了厚度为160 nm的Au帽，如图2（b），实现了牛奶中三聚氰胺的SERS检测。Zhao等^［43］通过FDTD模拟设计阵列Si的尺寸，利用光刻和纳米光刻技术相结合方法，在微流控 SERS芯片内制备了高度有序的Ag/Si纳米柱阵列，如图2（c），用于大型生物分子如DNA的检测，可获得高度可重复的SERS信号。Galarreta等^［44］采用自上而下纳米制造技术，在玻璃表面通过电子束光刻法制备Au三角形纳米结构，将其嵌入PDMS制成的微流控通道中，如图2（d），经过适配体序列修饰后，用于对赭曲霉毒素A进行选择性识别和SERS检测。Wang等^［45］采用自组装法制备的NaYF₄∶Yb，Er@SiO₂@Au复合SERS基底集成到“三明治”结构的微流控芯片（图2（e））上，在近红外激发下对R6G和大肠杆菌进行检测，具有良好的灵敏度和重现性。

图2 微通道中集成有序纳米基底的微流控SERS芯片^［41-45］

Fig.2 Microfluidic SERS chip based on fixed ordered nano-substrate in microchannel^［41-45］

采用“原位制造”方式获得的微流控SERS芯片，是指直接在微流控通道中进行SERS增强基底的制备，并可在固定的微纳米结构处同步实现待测样本的SERS光谱检测，常用的制备方法有化学法和飞秒激光技术等^［46］。

我们课题组^［47-49］通过自组装-化学镀法在微流控通道中原位制备了多种SERS基底，其中制备的Au@Ag/TIO₂ NTs基底对罗丹明6G的最低检出限为10^-¹⁰ mol/L，增强因子为1.15×10⁸。Parisi等^［50］首先通过原位电沉积Cu核/C鞘纳米墙，随后采用置换法原位合成Ag纳米颗粒从而制备了新型纳米墙结构的微流控SERS芯片（图3（a））用于结晶紫检测，检出限达5×10^-¹¹ mol/L，SESR增强因子达1.16×10⁹。Wang等^［51］采用化学置换方法，在微通道内制备三维Ag枝晶（图3（b））用于阿莫西林的SERS检测，检测限达到10^-³ mg/L。Lawanstiend等^［52］通过化学还原法将AgCl还原为Ag，在微通道中原位制备了具有SERS活性的介孔Ag结构，对唾液中的硫氰酸盐的检测限达到了10^-⁷ mol/L。

图3 基于微通道中原位制备有序纳米基底的微流控SERS芯片^［50-53］

Fig.3 Microfluidic SERS chip based on in-situ preparation of ordered nano-substrate in microfluidic channel^{［42-43，45-46］}

飞秒激光技术是另一种可用于在微流控通道中原位制备三维复杂纳米结构衬底的更新颖、强大的技术，其优点主要是可以在微流控通道的任何位置精确而灵活地形成各种图案的纳米结构。Xu等^［53］将银盐溶液注入芯片的微通道，利用飞秒激光脉冲聚焦于所需位置，将Ag⁺还原制备得到银纳米板，如图3（c）。后来，他们课题组^［54］用相同的方法制作了银微花阵列，如图3（d），用于原位监测4-硝基苯酚（4-NP）还原反应，对其还原产物4-氨基苯酚（4-AP）实现了监测。Xie等^［55］利用激光热效应催化原位制备得到高度可控、灵敏的3D Ag@ZnO 纳米簇SERS增强基底，由于纳米簇完全在激光光斑范围内生长，因此通过移动激光束可实现对三维Ag@ZnO纳米簇结构位置的编程控制。

在微通道中原位制备SERS基底可使SERS检测模式与微流控技术实现完美结合，使整个分析芯片具有多功能一体化和整体集成化的特性。原位制备SERS基底的微流控SERS系统可以实现更可控、更灵活的纳米结构基底制备，提供固定的热点，使样本的SERS信号具有更好的稳定性和重现性，检测灵敏度也更高。并且固定的微纳米结构可进一步修饰改性，在生化样本的检测灵敏度和选择性提升方面显示出强大优势。但是这种SERS基底的集成模式对纳米微结构制备技术要求较高，同时芯片的清洗难度大，难以重复利用。

3 基于微流控SERS芯片的致病菌高效鉴别和检测应用进展

由于致病菌生物组成复杂且光谱信息丰富，大多数生物分子拉曼散射截面相对较小，实际样品中存在致病菌样本量低、背景干扰复杂、菌种难辨识、菌量测试等问题^［56］，使得现有的分析测试技术面临巨大挑战。将微流控芯片分析与纳米技术进行有机融合，为在微芯片上实现生化样本的SERS光谱检测提供了更多的可行性，也为解决生化样本中致病菌快速辨识和监测难题提供了新路径和发展空间。

3.1　小型化SERS检测系统构建

由于常用的拉曼光谱仪一般配备多个不同波长激光器及各种复杂附件如显微镜、成像系统等，其大的体积及复杂工艺大大限制了其现场检测能力^［57］。微流控SERS芯片在芯片的微结构上就可以实现样本预处理功能，为了真正实现便携式的现场检测功能，结合微流控芯片构建小型化便携式的SERS检测系统也是人们关注的重点。虽然当前已经有研究将便携式拉曼光谱仪与微流控芯片相结合实现了分子的灵敏检测，但是在更多的研究中采用的还是实验室大型拉曼光谱仪，这主要是因为实验室拉曼光谱仪具有更高的灵敏度以及良好的成像系统。Liu等人^［58］利用便携式拉曼光谱仪在人字形微流控芯片上实现了河水中结晶紫的检测，检出限低至10^-⁸ mol/L。Dina等人^［59］通过便携式拉曼光谱仪以激光诱导的方式在微流控芯片中原位制备了银SERS基底，成功实现了对金黄色葡萄球菌、粪肠球菌和铜绿假单胞菌三种细菌的检测鉴别。总之，如何提高便携式拉曼光谱仪的检测与成像能力是未来研究的重要方向之一。

3.2　致病菌的快速鉴别

SERS是一种近场耦合效应^［6］，其增强效果随分子与金属表面的距离增加而快速递减^［11］。因此，致病菌的SERS光谱主要来源于与SERS基底直接接触的细胞壁，包括肽聚糖、脂多糖、膜蛋白等。由于每种致病菌具有独特的细胞壁组成，因此每种致病菌的SERS指纹谱存在差异，可用于致病菌的快速鉴别。但是，对于部分致病菌，尤其是同属不同种的，其SERS光谱比较相似或光谱特征不明显，通过肉眼难以识别，因此需采用化学计量学方法进行数据分析从而实现致病菌的精准识别。最常见的分析方法有主成份分析法（Principal Component Analysis，PCA）、偏最小二乘法（Partial Least Squares，PLS）、支持向量机方法（Support Vector Machines，SVM）和线性判别分析（Linear Discriminant Analysis，LDA）等^［60-62］。

Walter等^［9］利用微流控SERS芯片采集了9个不同大肠杆菌菌株的11 200个SESR光谱，建立了SVM分类模型，对9种大肠杆菌的分类正确率为92.6%。Mungroo等^［61］以银纳米颗粒为增强介质构建了微流控SERS芯片测试系统，结合PCA-LDA分析方法，对大肠杆菌、鼠伤寒链球菌、肠炎链球菌、铜绿假单胞菌、单核细胞增生性乳杆菌、英诺克李斯特菌、MRSA 35和MRSA 86 这8种病原菌实现有效辨识。Mühlig等^［62］设计了一种封闭液滴SERS芯片，采集了6种分枝杆菌的SERS光谱，利用PCA-LDA分析方法，成功区分了这6种细菌，分类正确率高于93%。SERS的光谱分析技术可以快速准确地实现致病菌鉴别，但将SERS光谱分析技术作为临床上可靠快速的致病菌鉴定手段，尚有许多工作需要完善，其中最重要的就是建立和完善细菌的标准SERS图谱数据库，而这需要众多科研工作者的共同努力。

3.3　生化样本中致病菌的分离富集及原位SERS检测

在实际生化样本检测中，细菌浓度低及复杂的背景干扰是制约致病菌快速定量检测的最大难点之一，微流控SERS芯片能够将致病菌的分离、富集及检测集中到一个平台上，从而更加快速、灵敏地实现对实际样本中致病菌的检测。

3.3.1　微流控SERS芯片上致病菌的分离富集

致病菌浓度在实际生化样本中通常很低^［18］，因此对致病菌进行分离富集并减少实际样品中的杂质干扰，进而获得可靠的致病菌指纹图谱是进行后续光谱分析与处理的前提。微流控SERS结合了微流控的微型、高效、自动化和SERS的高灵敏度等优势，可以在微流控芯片上进行细菌分离、富集等预处理，然后进行高灵敏度的SERS检测，从而实现致病菌的快速检测识别。微流控芯片中细菌富集方法可以分为两种，分别是被动分离富集（过滤、惯性微流等^［63-64］）及主动分离富集（离心沉降、介电电泳、光微流控、磁分离富集等^［65-67］）。

被动分离富集是指无外加能量而实现对细菌的分离富集，当前最成熟的方法是多孔膜过滤法。图4为用于细菌分离富集和检测的微流控SERS芯片^［68-70］。Krafft等^［68］设计了一种利用纳米孔膜实现细菌富集和SERS检测的三维微流控芯片，如图4（a），其由纳米多孔膜连接的两个垂直微通道组成，样品在多孔膜上被电驱动而流动，将待测细菌和AgNP簇在多孔膜上捕获、浓缩并进行原位SERS检测，实现了饮用水中大肠杆菌（2.47×10⁸ Cells/mL）和台湾假单胞菌（3.8×10⁷ Cells/mL的快速检测。Chang等^［69］设计了集成膜过滤和SERS增强基底的微流控系统，如图4（b），在芯片上进行了大肠杆菌的富集、代谢物收集和原位SERS测量，对大肠杆菌的最低检出限为10³ CFU/mL，比离心纯化过程降低了4个数量级。尽管基于过滤膜的微流控芯片制备比较简单，但是却存在吞吐量较低、不可重复使用以及对粘稠度高的生化样本不适用的问题^［71］。

图4用于细菌分离富集和检测的微流控SERS芯片^［68-70］

Fig.4Microfluidic SERS chip for bacteria separated， concentrated and detection^［68-70］

主动分离富集是指通过外加能量，如外加电场、磁场、激光操纵、声表面波等实现对细菌的分离富集。Cheng等人^{［70，72-73］}研制了多种DEP微流控SERS芯片对细菌进行分离、富集和SERS检测。他们通过在同心圆微流控器件的中心电极上制作纳米Au，如图4（c），在外加电压下可从人体血液中快速提取稀有病原菌，并使其富集于芯片SERS增强基底位置上进行SERS检测，利用获取的SERS光谱成功识别出了金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌，三种菌的的检出限分别为3×10³、1×10⁴和5×10³ CFU/mL^［70］。Witkowska等人^［74］利用磁分离微流控芯片将牙龈卟啉单胞菌从复杂样本中分离出来，获得了更好的牙龈卟啉单胞菌SERS信号。

3.3.2　基于SERS-Tag的致病菌的高效定量检测

微流控SERS芯片能够提供一种高灵敏度及可重复性的检测条件^{［67，75］}，同时集成微流控SERS平台可以避免光谱干扰，提高细菌检测的灵敏度，因此将SERS和微流体器件结合是实现灵敏检测、可重复性测量及良好定义空间检测区域的理想平台^［37］。当前致病菌主要依赖于SERS标签（SERS-Tag）进行定量检测。

Madiyar等^［77］报道了一种DEP微流控SERS芯片，通过在微流控芯片底部嵌入垂直排列的碳纳米纤维电极阵列，将SESR-Tag标记的大肠杆菌捕获和浓缩到200 μm×200 μm区域上进行SERS检测，实现了对大肠杆菌的定量检测，检测限低至210 CFU/mL，线性范围为5~10⁹ CFU/mL。Shi等^［79］设计了一种基于SERS的横向流动免疫分析法的生物传感器用于快速检测生物样品中的大肠杆菌O157∶H7。通过制备经两层拉曼报告分子DTNB和单克隆抗体修饰的金壳二氧化硅核纳米球结构作为SERS-Tag，与大肠杆菌O157∶H7有效结合后，在测试纸上形成三明治免疫复合物。通过测量DTNB的特征峰强度，可以轻松实现对大肠杆菌O157∶H7的定量检测，对PBS溶液中的大肠杆菌O157∶H7的检测限低至50 Cells/mL，对自来水、牛奶、人尿、生菜提取物和牛肉等生物样品中大肠杆菌O157∶H7的检出限为100 Cells/mL。Catala等^［78］设计了一种用于快速超灵敏定量检测人体体液中金黄色葡萄球菌的微流控芯片，通过检测经抗体或适配体功能化的SERS-Tag的报告分子MBA在1 078 cm^-¹处的拉曼峰的强度，实现了对尿液、血液、胸膜积液及腹水中金黄色葡萄球菌的检测，浓度低于15 CFU/mL。

由于致病微生物主要由拉曼散射截面较小的生物分子构成，拉曼活性较低，并且SERS基底与致病菌的表面接触有限，采集的SERS光谱不能全面地反映致病菌的指纹信息。因此，细菌检测的灵敏度和检测结果的重现性还有待提高。SERS 直接检测在复杂体系中极易受到干扰信息的影响，因此提高检测方法的选择性是 SERS 技术应用于实际复杂检测体系的关键。同时，由于细菌大小只有0.5~1.0 μm，很难将金属纳米粒子引进如此小的细菌中，所以，到目前为止SERS只实现了细菌表面细胞壁的探测^［79］。如何利用SERS检测的优势，认识并获取更多致病菌细胞内部的化学成分等信息，也将成为研究者们关注的课题。

4 结论和展望

集成微流控SERS芯片检测方法和技术具有多功能单元的集成、较少的样品量及微流体的一体化控制等优势，可为致病菌的高灵敏度、快速和高通量分析测试提供更好的平台，在致病微生物检测中具有良好的应用前景。

但是，集成微流控SERS芯片用于广泛的应用检测仍然面临诸多难题和挑战。现有研究显示，多数集成SERS的微流控芯片存在着信号重复性低和被分析物污染的问题。对于复杂样品，目标分析物与其它混合物的拉曼光谱可能有严重重叠，这时就需对目标物进行分离、富集等预处理，但是如何设计不同的功能区构型，实现芯片上样品的预处理和高通量、高灵敏度的 SERS检测，建立集成SERS微流控芯片分析系统和方法，还需要进行大量的探索。

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