不同环境因素和食品基质对Nisin抑制单增李斯特菌活性的影响

单增李斯特菌，是一种革兰氏阳性菌，在环境中分布较为广泛，具有较强的环境适应性，能在干燥、低温、高盐和极端pH等条件下长时间存活[1]。单增李斯特菌是一种人畜共患病食源性致病菌，主要以食物为媒介进行传播，可感染禽、蛋、肉类、乳制品、海产品、水果、蔬菜等食品，其产生的生物膜在食品加工和贮藏过程中长期存在，对食品工业和消费者都构成了安全威胁[2]。误食被单增李斯特菌污染的食物可导致人类感染李斯特病，致死率高达25%～30%；对老人、孕妇、婴儿及免疫力低下人群的影响较大，临床表现为败血症、脑膜炎、自然流产等症状[3]。因此，防治单增李斯特菌的污染问题是食品安全领域的研究重点之一。

乳酸链球菌素(Nisin)是由乳酸链球菌产生的一种小分子抗菌肽，由34个氨基酸组成；在细菌素分类中属于第Ⅰ类细菌素(羊毛硫抗生素)，对多种革兰氏阳性菌(包括芽孢)具有良好的抑制作用[4]。Nisin的抑菌机制主要分为2种模式，第一种是Nisin与细菌细胞膜结合后，其碳端与脂质通过静电相互作用插入细胞膜形成孔洞，从而导致细胞内容物泄露，细胞迅速死亡；第二种是Nisin与脂质Ⅱ(肽聚糖亚基从细胞质到细胞壁的主要转运体)结合，阻止了正常的细胞壁合成，干扰了细胞的正常代谢，从而导致细胞死亡[5]。作为一种微生物来源的天然防腐剂，Nisin具有安全、高效、无毒副作用等特点，进入人体后能快速被水解成氨基酸并被进一步吸收，不会在胃肠道残留，克服了使用化学防腐剂的安全隐患问题。MCMANAMON等[6]将Nisin应用于鲜切莴苣中，有效地减少了90%的单增李斯特菌，并将货架期延长2 d。KARINA等[7]研究发现，在新鲜牛肉糜中加入Nisin后，与对照组相比，单增李斯特菌增长到107 CFU/g的时间从1 d延长至8 d。OSHIMA等[8]发现Nisin在牛奶布丁中对3种芽孢杆菌都具有良好抑制作用，延长保质期的同时减少了热处理对牛奶布丁风味和香气的影响。尽管Nisin已被广泛应用于果蔬、肉类、乳制品等多种食品体系中，但环境因素和食品基质对食品体系中Nisin抑制单增李斯特菌效果的影响有待进一步研究。

本研究以单增李斯特菌为指示菌，采用2倍梯度稀释法测定了Nisin的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)，通过双层琼脂扩散法探究了不同环境因素(温度、pH和NaCl浓度)和食品基质(脱脂奶粉、卵磷脂和蔗糖)对Nisin抑菌活性的影响，以期为Nisin在食品加工和贮藏中的应用提供更多的理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌株与试剂

单增李斯特菌，扬州大学食品科学与工程学院肉制品实验室保藏。

脑心浸液肉汤(brain heart infusion broth，BHI)，青岛海博生物技术有限公司。

Nisin(效价为1 163 IU/mg)，山东福瑞达生物科技有限公司；琼脂粉、脱脂奶粉、大豆卵磷脂、蔗糖，生工生物工程(上海)股份有限公司；盐酸、氢氧化钠、氯仿(均为分析纯)，上海焱晨化工实业有限公司。

1.2 仪器与设备

SX-500高压蒸汽灭菌锅，Tomy Digital生物技术公司；DK-S28电热恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司；SPX-250B-D恒温培养箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；IN FINITE 200 PRO多功能酶标仪，瑞士Tecan公司；DT-00电子天平，美国双杰兄弟有限公司；ZHJH-21093超净工作台，上海诚智分析仪器有限公司；FE20K pH计，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 单增李斯特菌菌悬液的制备

将100 μL甘油保藏的单增李斯特菌接种于10 mL BHI液体培养基中，在37 ℃和150 r/min条件下振荡培养12 h后，使用无菌水稀释至107 CFU/mL，置于4 ℃冰箱待用。

1.3.2 Nisin MIC的测定

参考MOTA-MEIRA等[9]的方法，配制2 mg/mL的Nisin溶液，采用2倍梯度稀释法测定Nisin的MIC。分别取50 μL菌悬液与50 μL Nisin梯度稀释液混合，混匀后于37 ℃培养18 h，在600 nm处测定OD值。以50 μL BHI培养基和50 μL无菌水混合溶液作为阴性对照，以50 μL菌悬液与50 μL无菌水混合溶液作为阳性对照。

1.3.3 抑菌活性的测定

参考DE AZEVEDO等[10]的方法，通过双层琼脂扩散法测定抑菌活性。在培养皿底层倒入10 mL 1.8%纯琼脂，凝固后，均匀放置适量的无菌牛津杯，然后将200 μL单增李斯特菌菌悬液接种于20 mL BHI琼脂培养基，倒入培养皿，干燥后拔出牛津杯，在孔中加入不同处理的Nisin溶液100 μL，分别以对应的溶剂为空白对照。4 ℃冰箱预扩散8 h，再于37 ℃培养8 h后测定抑菌圈直径。

1.3.4 温度对Nisin抑菌活性的影响

取5份相同量的Nisin溶液(4 mg/mL)分别置于25、65、85、100、121 ℃处理30 min，待冷却后备用，以单增李斯特菌为指示菌测定抑菌活性。

1.3.5 pH对Nisin抑菌活性的影响

配制4 mg/mL的Nisin溶液，分别调节pH为2、3、4、5、6、7、8、9、10，混匀于室温下静置4 h后备用。以各个pH梯度的水溶液为空白对照，以单增李斯特菌为指示菌测定抑菌活性。

1.3.6 NaCl浓度对Nisin抑菌活性的影响

分别添加不同质量的NaCl于4 mg/mL的Nisin溶液中，使NaCl浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8 mol/L。混匀于室温下静置4 h后备用，以单增李斯特菌为指示菌测定抑菌活性。

1.3.7 脱脂奶粉质量浓度对Nisin抑菌活性的影响

向4 mg/mL的Nisin溶液中添加不同质量的脱脂奶粉，使溶液中脱脂奶粉质量浓度分别为0、20、40、60、80、100、120 g/L。常温摇匀30 min后备用，以单增李斯特菌为指示菌测定抑菌活性。

1.3.8 卵磷脂质量浓度对Nisin抑菌活性的影响

将Nisin加入氯仿中，配制成4 mg/mL的溶液，再加入不同质量的卵磷脂，使溶液中卵磷脂质量浓度分别为0、2、4、6、8、10、12 g/L。常温摇匀30 min后备用，以单增李斯特菌为指示菌测定抑菌活性。

1.3.9 蔗糖质量浓度对Nisin抑菌活性的影响

向4 mg/mL的Nisin溶液中添加不同质量的蔗糖，使溶液中蔗糖质量浓度分别为0、10、20、30、40、50、60 g/L。常温摇匀30 min后备用，以单增李斯特菌为指示菌测定抑菌活性。

1.4 数据处理

试验指标设3次重复，结果以平均值±标准差表示。试验数据采用SPSS 16.0软件进行数据统计分析，均值间采用Duncan法进行多重比较，在0.05水平上进行显著检验(P<0.05)；采用Origin 8.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 Nisin的MIC

不同Nisin质量浓度(1.95～1 000 μg/mL)对单增李斯特菌的抑菌曲线如图1所示。当Nisin溶液质量浓度为1.95～250 μg/mL，随着Nisin浓度的减小，培养液OD值呈上升趋势，说明该浓度范围内Nisin对单增特菌的生长抑制不足或无抑制作用；当Nisin质量浓度在250～1 000 μg/mL时，OD值的增长接近于零，说明单增李斯特菌的生长完全受到抑制。因此，Nisin的MIC为250 μg/mL。王双童等[11]研究2种天然抗菌肽对单增李斯特菌的抑菌作用，其中Nisin 的MIC为500 μg/mL。冯林慧等[12]研究了Nisin 对几种常见细菌和真菌的抑制效果，得到Nisin对单增李斯特菌的MIC为500 μg/mL。上述Nisin对单增李斯特菌的MIC均比本研究所得的MIC高，这可能与Nisin的来源、组分和效价存在差异有关。

图1 Nisin对单增李斯特菌的MIC
Fig.1 The minimum inhibitory concentration of Nisin against Listeria monocytogenes

2.2 环境因素对Nisin抑制单增李斯特菌活性的影响

2.2.1 温度对Nisin抑菌活性的影响

食品的加工及杀菌过程通常需要加热，Nisin的抑菌稳定性与温度存在联系，因此需要考察其对温度的耐受能力。本研究设置了室温(25 ℃)、巴氏杀菌温度(65、85 ℃)、正常煮沸温度(100 ℃)及高温灭菌温度(121 ℃)作为不同温度梯度，探究了不同温度对Nisin抑菌活性的影响。结果如图2所示。

图2 不同温度对Nisin抑制单增李斯特菌活性的影响
Fig.2 Effects of different temperatures on antibacterial activity of Nisin against Listeria monocytogenes
注：不同小写字母代表不同处理组在P<0.05 水平下具有显著性差异(下同)

与常温25 ℃处理的Nisin溶液的抑菌圈直径(14.30 mm)相比，经过65、85、100 ℃处理30 min后的Nisin溶液的抑菌圈直径无显著降低(P>0.05)，说明Nisin的热稳定性良好。在121 ℃处理30 min后的Nisin溶液的抑菌圈直径显著降低到11.75 mm(P<0.05)，说明Nisin的抑菌活性受到损失，但仍保留一定的抑菌效果。上述实验结果表明，Nisin具有良好的热稳定性，可以适应100 ℃以内的热加工处理，与吴雅萍等[13]的研究结果一致。

2.2.2 pH对Nisin抑菌活性的影响

不同的食品存在不同的酸碱性环境，为了探究pH变化对Nisin抑制单增李斯特菌效果的影响，选择常见的食品酸碱性范围(pH 2～10)进行试验，结果如图3所示。在pH=2时，抑菌圈最大，达到14.87 mm；在pH 为2～5时，Nisin的抑菌活性没有明显变化(P>0.05)；pH=6时，Nisin的抑菌圈直径显著下降至11.43 mm(P<0.05)；在pH 7～10，抑菌圈直径随着pH值的继续升高而显著降低(P<0.05)，pH=10时达到最低值8.73 mm。结果表明，酸碱性对Nisin抑制单增李斯特菌活性的影响较大；Nisin在偏酸性条件下可以更好发挥抑菌作用，在中性及碱性条件下其抑菌活性被削弱。

图3 不同pH对Nisin抑制单增李斯特菌活性的影响
Fig.3 Effects of different pH values on antibacterial activity of Nisin against Listeria monocytogenes

Nisin的抗菌活性很大程度上取决于其水溶性和结构稳定性，而结构稳定性又取决于酸碱度[5]。ROLLEMA 等[14]研究表明，Nisin的溶解度和化学稳定性均随着pH的升高而降低。LIU等[15]研究发现，Nisin 中特殊氨基酸脱氢残基的结构完整性是其发挥抑菌作用的主要因素。在高pH条件下，溶液中的亲核基团和脱氢残基之间发生反应，形成多聚体，导致脱氢基团的结构发生不可逆修饰，抑菌活性下降。此外，单增李斯特菌的最适生长pH为中性至弱碱性，酸性条件下，单增李斯特菌的生长受到抑制。本研究中Nisin 在酸性条件下抑菌效果比中性至碱性条件下抑菌效果好，可能还存在酸与Nisin的协同抗菌效应[16]。

2.2.3 NaCl浓度对Nisin抑菌活性的影响

大部分食品及食品环境中通常含有盐离子，对食品保鲜剂的作用存在一定的影响。本研究选择了食品中最常添加的盐离子Na+作为考察对象，将NaCl浓度控制在0.8 mol/L以内[17]，测定不同离子强度对Nisin作用的影响，结果如图4所示。

空白组不添加NaCl的Nisin溶液抑菌圈为14.10 mm，随着NaCl浓度升高，Nisin抑菌活性呈先上升后下降的趋势。NaCl浓度为0.2 mol/L时抑菌圈直径最大，达到15.07 mm，NaCl浓度0.4 mol/L时，抑菌圈直径为14.87 mm，与空白组相比，2组抑菌圈直径均显著升高(P<0.05)。当NaCl浓度升高到0.6 mol/L时，增强效果不明显(P>0.05)；NaCl浓度升高到0.8 mol/L时，抑菌活性被抑制，抑菌圈直径小于空白组。说明适当增加离子强度可以增强Nisin对单增李斯特菌的抑制。刘丽莉等[17]研究了不同食盐浓度对Nisin溶液抑制金黄色葡萄球菌效果的影响，结果表明，NaCl浓度在0.8 mol/L以内，抑菌效果随着离子强度的增大而增强，可能是由于NaCl引起的渗透压增大而增强了指示菌对Nisin的敏感性。GNZLE等[18]以弯曲乳杆菌、无害李斯特菌、沙门氏菌和大肠杆菌为指示菌，研究了食品成分及环境因素对3种细菌素(Nisin、sakacin P和curvacin A)抑菌活性的影响，添加NaCl后Nisin对无害李斯特菌的抑菌作用表现为中浓度升高，高浓度有所降低，并发现NaCl对细菌素抑菌作用的影响具有菌种特异性。

图4 不同NaCl浓度对Nisin抑制单增李斯特菌活性的影响
Fig.4 Effects of different NaCl concentrations on antibacterial activity of Nisin against Listeria monocytogenes

2.3 食品基质对Nisin抑制单增李斯特菌活性的影响

2.3.1 不同脱脂奶粉质量浓度对Nisin抑菌活性的影响

为了探究食品中的蛋白质对Nisin抑制单增李斯特菌活性的影响，用脱脂奶粉作为富含蛋白的食品模拟体系，测定不同脱脂奶粉质量浓度对Nisin抑菌活性的影响，可以反映Nisin在不同蛋白含量的食品中可能受到的影响。不同脱脂奶粉浓度对Nisin抑菌活性的影响如图5所示。

在脱脂奶粉质量浓度为0～120 g/L，随着浓度的增加，抑菌活性逐渐减小。与空白组相比，当脱脂奶粉质量浓度达到120 g/L时，抑菌圈直径从14.62 mm减小到10.53 mm，抑菌活性显著受到抑制(P<0.05)。杜琨[19]的研究表明，酪蛋白对Nisin抑制金黄色葡萄球菌的活性具有负面影响，抑菌效果随着酪蛋白浓度的升高而降低，与本研究结果一致。AASEN等[20]研究了sakacin P和Nisin与冷熏三文鱼、冷切鸡肉和生鸡成分的相互作用，结果表明，由于抗菌肽的两亲性，添加的sakacin P和Nisin有一部分能被食物基质蛋白迅速吸附，抗菌肽被吸附在食物大分子蛋白上以后，可能会发生蛋白质相互作用，形成蛋白质复合体，导致抑菌活性被抑制。

图5 不同脱脂奶粉质量浓度对Nisin抑制单增李斯特 菌活性的影响
Fig.5 Effects of different mass concentrations of skimmed milk powder on the antibacterial activity of Nisin against Listeria monocytogenes

2.3.2 不同卵磷脂质量浓度对Nisin抑菌活性的影响

磷脂是一类重要的油脂伴随物，主要存在于蛋黄、牛奶、动物内脏、动物肌肉以及动植物油脂中[21]。Nisin主要通过与细菌细胞膜上的磷脂结合而发挥抑菌作用，本研究以添加不同质量浓度的卵磷脂作为模拟体系，探究食品体系中的磷脂对Nisin抑菌活性的影响，结果如图6所示。

未添加卵磷脂时，Nisin抑菌圈直径为14.20 mm；质量浓度增加到2 g/L，抑菌圈直径显著降低至11.87 mm，且随着卵磷脂浓度的增加，Nisin抑菌活性不断减小；质量浓度达到12 g/L时，抑菌圈直径为9.10 mm，说明卵磷脂的存在对Nisin的抑菌效果具有显著的不利影响(P<0.05)，与杜琨的研究结果一致[19]。DEEGAN等[22]提出，Nisin的活性可能会受到肉类成分(如磷脂)的干扰，脂肪含量高干扰会更明显，可能是因为部分Nisin与磷脂结合，与细菌细胞膜结合的机会减少，导致抑菌效率下降。AASEN等[20]使用粗三文鱼油、鱼肝油、三丁酸甘油酯以模拟肉制品中的脂肪，将Nisin水溶液与3种油脂混合处理，探究脂肪对Nisin抑菌活性的影响。结果表明，处理2 h后，水相中的Nisin抑菌活性下降到理论添加量的60%～70%，说明脂肪可能会使液体食品和肉制品中的细菌素失活。BHATTI等[23]研究表明，脂肪含量>2%的均质化巴氏杀菌乳中存在的磷脂可以结合大部分添加的Nisin，导致可用于与单增李斯特菌细胞膜反应的Nisin减少，从而降低了抗菌活性。

图6 不同卵磷脂质量浓度对Nisin抑制单增李斯特菌 活性的影响
Fig.6 Effects of different mass concentrations of lecithin on the antibacterial activity of Nisin against Listeria monocytogenes

2.3.3 不同蔗糖质量浓度对Nisin抑菌活性的影响

糖类是大多数食品的重要组成成分之一，因此添加抗菌剂时，需要考虑其对抗菌效果的影响。图7显示了不同蔗糖质量浓度(0～60 g/L)对Nisin抑菌活性的影响。空白组抑菌圈直径为14.77 mm，质量浓度升高至20 g/L时，抑菌圈直径几乎没有变化，说明质量浓度为0～20 g/L，蔗糖对Nisin的抑菌活性无影响；质量浓度为30～60 g/L，抑菌活性逐渐降低；质量浓度达到60 g/L时，抑菌圈直径为12.97 mm，与空白组相比有显著的降低(P<0.05)，抑菌活性受到抑制。

图7 不同蔗糖质量浓度对Nisin抑制单增李斯特菌活性的影响
Fig.7 Effects of different mass concentrations of sucrose on the antibacterial activity of Nisin against Listeria monocytogenes

蔗糖作为碳源可以提供能量，促进细菌的生长代谢。郑正男等[24]以多种微生物为指示菌，研究了蔗糖浓度对单宁酸抑菌效果的影响，发现随着蔗糖浓度的增加，其中2种指示菌的生长加快，影响了单宁酸的抑菌效果，其他指示菌没有显著变化。因此，蔗糖浓度的增加可能促进了单增李斯特菌的生长，增强其对Nisin的抵抗作用，导致抑菌圈直径减小。杜琨[25]以金黄色葡萄球菌为指示菌，测定了蔗糖浓度对Nisin抑菌活性的影响，发现随着蔗糖浓度的增加，Nisin的抑菌效果增强，与本文研究结果不一致，可能是因为不同菌种对相同抗菌剂的敏感性不同，导致糖类对抗菌剂活性的影响存在菌种特异性。

3 结论

本研究结果表明，Nisin对单增李斯特菌的MIC为250 μg/mL，121 ℃高温处理30 min后仍保留一定活性，热稳定性较好；而Nisin受到pH的影响较大，在中性至碱性条件下活性损失较大；在添加不同浓度NaCl后，发现一定浓度的NaCl溶液有增强Nisin抑菌活性的作用，抑菌圈直径增大。考察了3种食品基质对Nisin抑制单增李斯特菌活性的影响，脱脂奶粉和卵磷脂对Nisin的抑菌活性有较大的抑制作用，蔗糖的添加有利于微生物的生长，影响了Nisin作用的效果。因此在使用Nisin作为保鲜剂时，可以承受100 ℃以内的加工温度，高温杀菌产品需要考虑添加顺序。Nisin可以在酸性食品中发挥更好的活性，并且在食品中添加适量的NaCl能有效增强Nisin抗菌活性。为了减少与食品基质的相互作用，可以将Nisin包埋进微囊、脂质体或包装膜，制备抗菌活性包装膜，有效提高其抑菌稳定性及效率。