高效液相色谱技术检测β―地中海贫血的临床价值探讨-医学论文

β―地中海贫血（β-thalassemia）简称β―地贫，是由于常染色体遗传性缺陷，导致β―珠蛋白链的合成受到抑制或部分抑制而引起的一组严重危害的遗传性溶血性贫血，常见于地中海，美国黑人，东南亚，印度次大陆以及中国地区，已成为全球性的公共健康问题^[1]。在我国，以长江以南各省发病率最高，其中广西省，广东省，福建省为β―地中海贫血高发区^[2]。目前，基因检测是诊断β―地中海贫血的最可靠方法，但由于该实验技术要求高，操作繁琐，价格昂贵且不易进行有效的质量控制，故不适合于做大规模的人群筛查。而目前常规使用的平均红细胞体积（MCV），平均血红蛋白（MCH），红细胞脆性试验，血红蛋白电泳等筛查方法，虽操作简便，成本低廉，但又因其敏感性和特异性较低，人为影响因素较大，误诊和漏诊现象较严重等问题，近年来已逐步开始被快速、准确、经济的高效液相色谱法（HPLC）所取代。本文以反向斑点杂交（RDB）方法为金标准,使用24条探针,同时检测中国人群中β―地中海贫血最常见的8个位点和9个少见位点突变，对已确诊的128例β―地中海贫血携带者及53例正常对照，回顾性分析其HPLC血红蛋白分析中的HbA2含量，从而评价HPLC法在β―地中海贫血中的诊断价值。

1资料与方法

1.1资料  2009年1月到2010年6月在我院遗传门诊咨询的患者 308例，选择经基因诊断证实为β―地中海贫血的患者128名（患病组）及非β―地中海贫血人群53名（对照组），年龄1至43周岁，抽取其静脉血2毫升，EDTA抗凝。

1.2方法

1.2.1 HbA2含量测定 采用高效液相色谱法（HPLC）进行血红蛋白分析，仪器为美国BIO-RAD公司VARIANTⅡ全自动血红蛋白分析仪，使用配套试剂及质控品，严格按照仪器使用说明书进行操作。诊断标准：β―地中海贫血HbA2>4.0%。

1.2.2 β―地中海贫血基因诊断 采用深圳益生堂生物企业有限公司的β―地中海贫血基因检测试剂盒，经DNA扩增后，用膜反向杂交技术，使用24条探针，同时检测中国人群常见的8个位点：CD41-42（-TCTT），IVS-2-654（C→T），CD17（A→T），-28（A→G），CD26（G→A），CD71-72（+A），CD43（G→T），-29（A→G）和9个少见位点突变：起始密码子ATG→AGG，CD14-15（+G），CD27-28（+C），-32（C→A），-30（T→C），IVS-1-1（G→T），IVS-1-5（G→C），CD31（-C），CAP+40—+43（-AAAC）。操作严格按照说明书进行。

1.2.3试验评价指标 按下列几个参数对HPLC法在β―地中海贫血中的诊断价值进行评价，即灵敏度（Se）= a / (a + c)×100％，特异度（Sp）= d / (b +d)×100％，准确度（Ac）= (a + d)/ (a +b + c +d)×100％，阳性预测值（PPV）= a / (a + b)×100％，阴性预测值（NPV）= d / (c +d)×100％。其中a为HPLC法检测患病组中的阳性数，b为该法检测对照组中的阳性数，c为该法检测患病组中的阴性数，d为该法检测对照组中的阴性数。

2 结果

2.1  128例β―地中海贫血患者和53例对照中，其HPLC法检测结果详见表1。

      表1  HPLC法与基因分析法检测β地贫结果比较

                               HPLC法（β地贫）

基因分析

阳性                         阴性

阳性                  127                          1

阴性                  2                            51

2.2 HPLC法用于β―地中海贫血诊断的临床价值评价结果，详见表2。

                 表2   HPLC法的实验评价指标

 灵敏度Se  特异度Sp   准确度Ac  阳性预测值PPV  阴性预测值 NPV

     (%)        (%)        (%)            (%)              (%)

   99.2       96.2        98.3           98.4              98.1

2.3经基因检测明确诊断的128例β―地中海贫血患者中，基因型分布情况及各基因型所占的比例，详见表3

表3 β地贫基因型及所占百分比

基因突变类型                  例数（n）               百分比（%）

IVS-2-654（C→T）             67                      52.3

CD41-42（-TCTT）             37                      28.9

CD17（A→T）                 14                      10.9

-28（A→G）                   7                       5.5

CD27-28（+C）                 1                       0.8

CD43（G→T）                 1                        0.8

CD26（G→A）                 1                          0.8

3讨论

β―地中海贫血是世界上最常见和发病率最高的遗传性溶血性贫血,也是危害最严重的血红蛋白病之一^[3]。由于该病至今尚无有效的治疗方法，预防是最为有效的应对措施，而临床上有相当一部分轻型或静止型的β―地中海贫血患者没有临床症状，但却携带致病基因，并可能将异常基因遗传给下一代，故如果夫妻双方均为同一类型基因杂合子时，后代有四分之一的可能出现重型β―地中海贫血患儿，且此类患儿常在出生后几个月就开始贫血，临床症状严重，必须依靠长期输血以维持生命，对社会和家庭都将带来沉重的经济和精神上的负担，所以提倡婚前进行β―地中海贫血筛查及对未进行婚检的孕妇进行产前β―地中海贫血筛查显得尤其重要，对筛查出的高风险人群进行基因诊断，必要时对孕妇进行羊膜腔或脐静脉穿刺，抽取羊水或脐血进行胎儿产前β―地中海贫血基因诊断，如确诊为重症患儿应建议给予引产，从而降低了围产儿死亡率和出生缺陷儿发生率，对提高出生人口素质，切实做好优生优育工作具有重要意义。

目前，β―地中海贫血非基因检测技术很多，如血常规，红细胞渗透脆性试验等^[4]，此类方法操作要求低，费用低廉，但敏感性差，特异性不高，且部分患者MCV及红细胞渗透脆性试验可以正常，是造成β―地中海贫血基因携带者漏诊的主要原因，漏诊率达到13.23％^[5]。而近来广泛应用的血红蛋白电泳法也存在着准确性和重复性不佳的缺点^[6]。故国际地贫协会现已推荐使用高效液相色谱法作为β―地贫常规筛查方法。HPLC是采用离子交换层析法自动快速分析血红蛋白，此方法分离率高，可以把理化性质相差不大的混合物通过简单的分离技术，使微小差异的各组分通过几百次甚至几千次的重复累积为大的差异而达到分离，特别适合于生物大分子如各种血红蛋白组分的分离。而β―地中海贫血是由于β珠蛋白基因突变使β珠蛋白链合成受阻所致，此时机体为代偿β珠蛋白链的减少，而使δ珠蛋白基因的转录升高，合成增加的δ珠蛋白易与相对过剩的α－珠蛋白链结合生成过多的HbA2。故通过检测血红蛋白中的HbA2含量，可以达到筛查β―地中海贫血的目的，若此值高于诊断标准，高度怀疑β―地中海贫血,建议做基因检测以进一步明确诊断。

在本次研究中，我们对经基因确诊的β―地中海贫血患者128例，及正常对照53名进行回顾性分析，从实验灵敏度，特异度，准确度，阳性预测值和阴性预测值等方面对HPLC法进行了一个全面系统的评价，证实了HPLC的确为β―地中海贫血介于筛查与诊断之间的一个比较理想的方法。此外，对于研究中出现的一例β―地中海贫血基因携带者，其HPLC法测得的HbA2虽正常，但检测中其HbF及血红蛋白出峰图谱均提示可能同时携带α―地贫，于是对其进行了α―地贫基因检测，果然得到证实，故考虑该患者同时携带两种地贫基因，由于α、β珠蛋白生成都减少，导致HbA2正常甚至可能偏低，从而掩盖了β―地中海贫血HbA2增高的现象。与此相反，当出现HPLC法阳性，而常规基因位点分析未检出突变的现象时，应考虑两种可能存在，一是HPLC法检测HbA2时，血红蛋白D和E在HbA2被洗脱的同时也一起被洗脱下来，此外成分很少的HbS和其他类型的血红蛋白也可与HbA2一同被洗脱，造成HbA2假性升高，但此种现象较少出现。二要结合临床表现及其他实验室检查结果，对高度怀疑为β―地中海贫血的患者应考虑是否存在罕见的基因突变类型未在所检测的基因位点之列，以防出现漏检现象。在此次研究中，我们就对HPLC法阳性而常规基因分析阴性的其中一个标本进行了更深一步的研究剖析，最后明确其为一种国内外尚未见报道的新型β―地中海贫血基因突变类型，突变位点为Codon36(- C)，这也证实了在做常规基因分型的同时，用HPLC法进行血红蛋白分析的重要性，它可充分弥补常规基因检测类型较少的不足。此外，HPLC技术还可准确分析HbF，以及HbS等异常血红蛋白带^[7]，甚至能分离出血红蛋白电泳所无法区分的条带，且受人为因素影响小，实验方便快速，费用低廉，检测通量大，完全可以取代其他筛查方法用于临床中β―地中海贫血的辅助诊断，尤其适用于大规模的人群筛查。

4 参考文献

1 Vichin sky EP. Changing pattems of thalassemia worldwide[J]. Ann N Y Acad Sci,2005,1054(1):18-24.

2杜传书. 地中海贫血研究的现状与未来[J].中华医学遗传学杂志,1996,13(5):257

3郑美琴，李伟，吕建新. 温州地区汉族人群β―地中海贫血患者β珠蛋白基因突变分析[J].中华检验医学杂志,2010,33(3):236

4覃西，毛炜，吴洁等. 非基因法检测地中海贫血现状[J].中国优生与遗传杂志,2007,15(3):122-124

5朱学海，魏代奎.地中海贫血的基因诊断分析[J].中国实用医药,2008,3(13):126-127

6 Colah RB, SurveR, Sawant P, et al. HPLC studies in hemoglobinopathies [J] .Indian Pediatr,2007,74(7):657-662

7 Wajcman H. Diagnosis and screening of sickle cell disease [J]. Rev Prat,2004,54(14):1543-1547