侧流胶体金免疫试纸快速测定牛奶中的泰乐菌素

大环内酯类抗生素是非常重要的一类抗菌化合物，广泛用于人类和兽医的治疗和预防[1]。泰乐菌素(tylosin，TYL)是最常用的预混大环内酯类抗生素，对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌、支原体、巴斯德氏菌以及衣原体具有很高的活性[2]。它们被广泛用于动物生产中，以预防和治疗家畜的肠道和呼吸道感染[3-4]。滥用抗生素可能会在可食用的动物组织和牛奶中留下残留物，对消费者健康造成不利的影响。因此，许多国家禁止在饲料添加剂中使用TYL，它于1998年在欧盟被禁止。在中国，可食用动物组织中TYL的最大残留限量(maximum residue limit，MRL)规定为50 μg/kg(牛奶)和200 μg/kg(肌肉组织)[5]。牛奶中TYL的MRL也是巴西农业、畜牧和食品供应部在牛奶中TYL残留法规中采用的MRL。这与欧盟和美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)要求的MRL一致[6-7]。为了评估TYL的残留量，需要灵敏的分析方法以确保低浓度下的测定。文献揭示了几种测定肌肉组织中TYL残留的方法，如HPLC[8-9]、薄层色谱[10]、LC-MS/MS[11-12]和酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)分析[13]。尽管这些方法准确可靠，但它们昂贵，预处理(尤其是提取和纯化)复杂且耗时，因此不适用于现场测试或常规分析的高通量分析筛查[14]。从实践的角度来看，开发一种简单，低成本，省时的筛选技术至关重要[15]。

自1980年初期发展以来，侧流免疫层析测定技术已获得广泛认可[16]，其受欢迎的主要原因是测试设计的简单性。侧流免疫层析测定装置紧凑且易于携带，大多数不需要外部试剂即可获得结果，添加液体样品将启动并完成测试，结果快速且易于解释，通常无需借助仪器，检测试纸条的制造相对容易且便宜。近年来，侧流免疫层析试纸被用作检测激素[17]、病毒(艾滋病毒、乙肝和丙型肝炎、新冠病毒)[18-20]、细菌[21]和寄生虫等抗原的流行诊断工具[22]。对于较小的分析物，可以使用竞争性ELISA测定[23]，检测试剂通常是针对分析物的胶体金标记抗体。捕获线通常是与固定在膜上的载体蛋白缀合的分析物。样品中的分析物将与固定在膜上的分析物竞争，从而与检测抗体结合。样品中存在的分析物越多，它将越有效地阻止胶体金标记抗体的捕获。因此，样品中分析物数量的增加将导致读出区域中信号的减少[24-25]。到目前为止，竞争性剥离测试主要用于检测小分子物质(半抗原)，尤其是在动物饲养中滥用的药物。这种竞争性测定的检测极限可以达到ppb水平(每克样品分析物的纳克级数)。

在这项工作中，针对TYL的免疫原，产生了TYL的特异性单克隆抗体(monoclonal antibodies，mAb)。在此基础上，开发了一种单步免疫色谱测试条，用于检测牛奶中的TYL残留性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

氯金酸和酪蛋白，American Sigma Company；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)，American Amresco Company；辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)，American Jackson Laboratory；聚氯乙烯(polyvinyl chloride，PVC)塑料片、血液滤过膜、吸收纸，上海金标生物技术有限公司；硝酸纤维素(nitrocellulose membrane，NC)膜，American Millipore Company。

1.2 仪器与设备

Forma 371 Steri-Cycle酶标仪，Thermo Fisher；XYZ Biostrip分配器、CM 4000切割机，美国加利福尼亚州Bio-Dot。

1.3 免疫原的偶联

通过碳二亚胺法制备该程序中的TYL。将5 mg的TYL溶解在磷酸盐缓冲液(phosphate buffer，PBS，pH 7.0)中，然后加入10 mg的碳二亚胺化合物。将混合物在黑暗中于4 ℃搅拌约6 h。将BSA或卵清蛋白(ovalbumin，OVA)溶解在PBS缓冲液中，并加入混合物中。TYL与BSA或OVA的摩尔比为25∶1。将免疫原BSA-TYL(OVA-TYL)在室温下搅拌过夜，并用PBS透析约3 d [26]。通过紫外光谱和SDS-PAGE分析免疫原。免疫原在-20 ℃的条件下保存。

1.4 单克隆抗体生产

用3种免疫原中的每一种免疫5只雌性BALB/c小鼠(6周龄)(每只小鼠的剂量为50 μg蛋白)，以产生mAb。每2周使用弗氏完全佐剂中的免疫原乳剂对小鼠进行皮下免疫。第三次免疫后从每只小鼠收集血清，并通过ELISA监测抗体滴度。处死具有最高抗体滴度的小鼠，并使用SP2/0骨髓瘤细胞融合脾细胞。融合的细胞在HAT培养基中繁殖。融合后，使用HAT培养基针对选择未融合的细胞。在选择融合细胞之后，将HAT培养基替换为HT培养基。使用非竞争性间接ELISA筛选生长中的杂交瘤细胞中抗体的产生。通过有限稀释法将产生针对TYL的特异性mAb的杂交瘤亚克隆2次。收集亚克隆的杂交瘤细胞，离心并在液氮中冷冻[20]。用饱和硫酸铵沉淀法纯化杂交瘤小鼠的腹水，并用于间接竞争ELISA(icELISA)。

1.5 间接竞争ELISA

微量滴定板的每个孔均涂有100 μL包被抗原。将板在4 ℃下孵育过夜，然后用200 μL封闭缓冲液(0.01 mol/L含50 g/L BSA的PBS)封闭。随后将50 μL最佳抗体稀释液和50 μL具有连续稀释度的TYL标准液添加到孔中，并将滴定板在37 ℃下孵育30 min。洗涤后再加入100 μL稀释的山羊抗小鼠IgG-HRP溶液，并将板在37 ℃下孵育30 min。洗涤后，加入100 μL 3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine，TMB)底物(在0.05 mol/L柠檬酸缓冲液中，pH 4.5 的10 g/L TMB和H2O2)，在37 ℃ 孵育10 min后，反应用2 mol/L H2SO4终止反应。然后，用在450 nm处测量吸光度OD450值。为了间接比较不同的校准曲线，将OD450值转换为相应的测试抑制率，如公式(1)所示：

测定抑制率

(1)

式中：B，OD450值；B0，非竞争性抗原OD450值；Bck，阴性对照OD450值。

1.6 胶体金标记单克隆抗体的制备

通过用10 g/L柠檬酸钠控制还原氯化金来制备平均直径为15 nm的胶体金。简而言之，将50 mL的0.1 g/L氯化金三水合物的超纯水溶液(Millipore，美国)加热至沸腾，然后在搅拌的同时添加1 mL的10 g/L柠檬酸钠溶液。颜色从浅黄色变为亮红色后，将溶液再煮沸5 min，以完成氯化金的还原。用碳酸钠(0.2 mol/L)将胶体金溶液的pH值调节至9.0。通过以下步骤确定最佳的蛋白质标记浓度[27]：将25 μL抗-TYL mAb溶液与25 μL胶体金溶液混合。将混合物在室温下孵育15 min，然后添加100 μL的100 g/L NaCl溶液。用于胶体金标记的mAb的最佳浓度是不改变颜色的最低mAb溶液浓度。在20 mmol/L硼酸钠(pH 9.0)中加入1 mL 100 g/L BSA溶液后，将混合物在室温下再孵育10 min，然后在10 ℃下通过重复离心(25 000×g)洗涤标记的mAb用含有10 g/L BSA和1 g/L叠氮化钠的20 mmol/L硼酸钠(pH 9.0)处理30 min。沉淀物重悬在洗涤缓冲液中，并保存在4 ℃以便使用[20]。

1.7 TYL试纸条的组装

免疫层析卡包括样品垫、共轭垫、NC膜、吸收垫、PVC底板以及检测线和质控线，并在其两端覆盖有彩色膜。TYL与BSA连接，然后用作检测线捕获试剂(BSA-TYL)。将山羊抗小鼠IgG用作捕获试剂，在NC膜上进行测试。金标抗体用量按照上述优化后的条件加入96孔板的微孔，在40 ℃下干燥1 h后，将膜密封并在室温下在干燥条件下贮存。通过用20 mmol/L含87.5 g/L蔗糖，87.5 g/L BSA，0.6 mol/L NaCl的硼酸钠缓冲液(pH 8.0)将胶体金标记的mAb稀释为TYL制备缀合物溶液。10 mmol/L EDTA和1 g/L 叠氮化钠的终质量浓度为2 μg/mL。将7 mm×300 mm 玻璃纤维(Millipore，MA，USA)浸入共轭溶液中，制成共轭垫，然后在56 ℃下干燥1 h。样品垫和吸收垫是由无纺布的100%纯纤维素制成的[25,28]。使用切割机将主卡切成3 mm宽的条。然后将条带在干燥剂凝胶存在的情况下密封在塑料袋中，并保存在4 ℃下。

1.8 测试程序和原则

牛奶样品在5 000 r/min下离心15 min以去除脂肪。将一块测试条插入80 μL标准样品中10 s，然后将其平放以使溶液迁移。胶体金标记的抗TYL mAb被固定在膜上的BSA-TYL捕获，形成一条清晰的红色测试线。过量标记的抗TYL mAb进一步迁移并被形成对照系的山羊抗小鼠IgG抗体捕获，完成测试需要10 min。如果样品中存在TYL，它将与测试线上的固定BSA-TYL竞争，以结合有限量的胶体金标记的抗TYL mAb(图1)。

图1 胶体金免疫层析试纸条检测原理示意图[29]
Fig.1 Schematic diagram of the detection principle of colloidal gold immunochromatographic test strips[29]

1.9 统计分析

使用统计软件SPSS 11.0和数据处理系统14.0(data processing system，DPS)进行统计[30]。数值表示为平均值±标准差。所有数据均适用于分析，无需任何转换。

2 结果与分析

2.1 mAb对TYL的影响

通过ELISA法评估了针对TYL的单克隆抗体mAb对TYL的影响。抗体效价表示为最大稀释度的倒数，最大稀释度产生的OD450值比阴性对照高2.1倍。结果表明，抗体效价为2.56×10-5(图2)。将IC50(IC50是捕获在测试线上的胶体金标记的抗TYL mAb 50%抑制的浓度。交叉反应性表示为竞争者的IC50浓度除以TYL的百分比)评估为50%测试抑制率下的TYL浓度。结果表明，IC50为4.609 1 ng/mL。通过用PBS稀释TYL来建立ELISA的标准抑制曲线(图3)。

图2 抗TYL抗体滴度
Fig.2 Anti-TYL antibody titer
注：NC为阴性对照

图3 icELISA的抑制曲线
Fig.3 Inhibitory curves by icELISA
注：标准曲线的标准质量浓度为1、2、4、8、16、32 ng/mL, 以标准样品取对数计算

2.2 试纸的灵敏度

通过测试TYL标准样品来预测试纸条的灵敏度。用读数仪扫描检测线。G/Peak和G/D×相对光密度(relative optical density，ROD)的面积随着标准样品中TYL浓度的增加而降低(图4和表1)。

使用无污染牛奶测定了检出限(limit of detection，LOD)。LOD以阴性样品20次测定结果的平均值加3倍标准偏差计算。与阴性对照(NC)相比，LOD对应于G/D×Area-ROD下降10%的浓度。结果表明，使用扫描仪计算出的LOD为1.563 4 ng/mL，而使用眼睛计算出的LOD为10 ng/mL。计算其IC50为7.836 2 ng/mL。

图4 标准样品的ROD曲线
Fig.4 ROD curves of standard samples
注：使用测试条测试了0、2、4、8、16、32、64 ng/mL的标准TYL样品； 用TSR3000膜条读取器扫描测试线(309 mm×188 mm，分辨率72×72)

表1 G/Peak和G/D×标准样品测试线的ROD面积
Table 1 G/Peak and G/D×Area of the ROD of test lines of standard samples

2.3 试纸的特异性

根据四参数对数方程，抗TYL mAb对TYL和其他兽药的IC50和反应性如表2所示。计算得出TYL的IC50为7.836 2 ng/mL，而其他兽药(包括替米考星、螺旋霉素、交沙霉素、罗红霉素、红霉素、阿奇霉素、磺胺甲氧二嗪、克仑特罗、链霉素和莱克多巴胺)IC50值均>3 000 ng/mL。近年来，许多研究人员开发了ELISA方法来检测动物尿液和组织中的TYL[5,31-32]。众所周知，这种方法至少需要3～4 h才能完成。相反，本发明的免疫层析侧流试纸条是一步测定，需要的专业人员和实验仪器少得多。此外，就潜在的交叉反应性而言，与检测TYL残基的多克隆抗体相比，单克隆抗体似乎是更好的解决方案。

2.4 试纸和HPLC之间的比较研究

作为比较任务，HPLC分析[27]被用作鉴定和定量牛奶中TYL的确认方法。从河南省的10个农场中随机抽取10个有代表性的测试样品。结果如表3所示。与HPLC检测相比，期望的最小符合率<15%。

表2 抗TYL单抗与其他兽药的反应性
Table 2 Reactivity of anti-TYL mAb with other veterinary drugs

尽管发现HPLC、ELISA和试纸条都适合分析生物样品中的TYL残留，但ELISA和试纸条更为灵敏。当样品中存在高浓度的TYL时，HPLC和试纸条给出的结果一致或几乎相同，而当样品中存在低浓度的TYL时，其读数却不同(表3)。原因是TYL的量已达到定量极限。在TYL浓度低于HPLC定量限的条件下，测试条是分析TYL残留的更好选择。

表3 用试纸条和HPLC分析检测牛奶中TYL 残留的测试结果比较
Table 3 Comparison of testing results with test strips and HPLC analysis for detection of TYL residues in milk

3 结论

本文以牛奶中的TYL为免疫原，成功开发了使用TYL特异性mAb的侧流胶体金免疫层析试纸条。通过和HPLC、ELISA检测方法的比较，发现试纸的LOD为1.563 4 ng/mL,IC50为7.836 2 ng/mL，与ELISA的检测结果有良好的符合率，该指标完全可以满足国家的最低标准要求。结果表明，它对牛奶样品中TYL残留的检测具有很高的特异性和灵敏度。特别是，无需特殊设备，即可在20 min 内获得结果。综上所述，这种牛奶中的TYL快速检测方法，对于牛奶饮用安全性提供了保障。