葡萄糖浓度波动对INS-1细胞胰岛素分泌的影响-医学论文

　　高糖分为持续性高糖及波动性高糖，研究发现波动性高糖同样可以导致严重的胰岛素分泌功能的损伤[1-2]，其机制并未完全研究清楚。细胞ATP是近年来研究的热点，近年来发现胰岛素的分泌和胰岛β细胞内的ATP含量关系密切[3-4]。本实验拟用含不同葡萄糖浓度及是否含抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）的培养液干预INS-1 细胞，通过比较持续性高糖及波动性高糖对ATP生成的影响及影响机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　RPMI 1640-培养基购自GIBAO，胎牛血清购自上海微科生化试剂有限公司，N-乙酰半胱氨酸及ATP检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养 INS-1细胞贴壁生长于含有10%胎牛血清、0.6 mol/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、1 mmol/L 丙酮酸钠、50 mol/L 2-巯基乙醇的普通RPMI 1640-培养基中，置于37℃、5%CO2、95%空气饱和湿度孵箱中培养。

　　1.2.2 实验分组 将INS-1细胞随机分为正常糖组（5.5 mmol/L葡萄糖培养液培养）、持续高糖组（16.7 mmol/L葡萄糖培养液培养）、波动组（用16.7 mmol/L葡萄糖培养液培养2 h，再换5.5 mmol/L培养3 h，每天重复3次，夜间9 h维持在5.5 mmol/L的培养液中）、NAC+正常糖组、NAC+持续高糖组、NAC+波动组，后3组的培养基中均预先负载终浓度为1.0 mmol/L NAC，余干预措施相同，均干预72 h。每组5个培养皿。各组每日均同时更换培养基以保持相同的处理条件，培养基事先恒温箱37 ℃水浴，以减少对细胞的损伤。

　　1.2.3 测定的指标及方法 分组干预结束后，用荧光素酶法检定细胞ATP含量，分别用2.8 mmol/L和16.7 mmol/L葡萄糖各刺激INS-1细胞1 h，收集上清后放免法测定其胰岛素分泌水平，分别作为基础和高糖刺激下胰岛素释放，计算高糖刺激胰岛素分泌/基础胰岛素分泌作为胰岛素分泌能力结果。结果均以胰岛细胞总蛋白校正。

　　1.3 统计学方法

　　数据用SPSS 13.0统计软件进行处理，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用方差分析，各组内均数比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，若方差不齐采用Welch近似方差分析；多重比较采用LSD法（Least-significant difference test），两两比较用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 不同浓度葡萄糖及抗氧化剂对INS-1 细胞胰岛素分泌水平的影响

　　六组基础胰岛素分泌（2.8 mmol/L 葡萄糖刺激）差异无统计学意义（P > 0.05），高糖刺激胰岛素分泌（16.7 mmol/L葡萄糖刺激）差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

　　
　　表1 六组INS-1细胞的基础胰岛素分泌及高糖胰岛素分泌(x±s，n=5）

　　
　　2.2 不同浓度葡萄糖及抗氧化剂对INS-1 细胞ATP含量及胰岛素分泌能力的影响

　　由表2可知，与正常糖组相比，持续性高糖组及波动组的胞内ATP含量及胰岛素分泌能力显著下降（P < 0.01），且波动组下降更明显。使用抗氧化剂NAC干预持续性高糖组及波动组，两组的细胞ATP含量及胰岛素分泌能力均较未使用组显著增加（P < 0.05）。

　　3 讨论

　　近年来，血糖波动的危害越来越受到关注，研究发现波动性高血糖不仅促进糖尿病慢性并发症的发生和发展[5-7]，也可损伤β细胞的胰岛素分泌功能[1-2]。本研究发现，波动性高糖及持续性高糖均可损伤INS-1细胞的胰岛素分泌能力，且波动性高糖更严重。

　　已有研究发现，胰岛β细胞胰岛素分泌与ATP合成相偶联[3-4]。葡萄糖刺激胰岛素分泌的重要机制是葡萄糖增加ATP的合成，减少游离二磷酸腺苷，导致ATP敏感性K+通道关闭，细胞去极化，Ca2+通过钙电压门控通道内流，并产生一系列的级联放大效应使胰岛素分泌颗粒胞吐，胰岛素分泌到细胞外[4]。本研究结果发现，ATP含量在持续性高糖组及波动组均较正常糖组显著下降，且波动组下降更明显。本研究提示，波动性高糖及持续性高糖可能通过降低INS-1细胞的ATP生成降低其胰岛素分泌能力，且波动性高糖更严重。

　　高糖可引起胰岛β细胞功能紊乱，胰岛素分泌功能受损，其机制较复杂。近年来大量文献证实氧化应激在β细胞的损伤中发挥的重要作用[8]。胰岛β细胞系INS-1细胞株表达氧自由基清除酶少，对氧化应激损伤高度敏感，本实验采用该细胞株进行研究。已有多篇文献证实抗氧化剂NAC能够保护胰岛β细胞的分泌功能[9]，本研究用NAC处理后发现，NAC+波动组及NAC+持续高糖组的细胞ATP含量及胰岛素分泌能力分别较波动组及持续高糖组显著增加，抗氧化剂可以显著改善细胞ATP及胰岛素分泌能力，提示波动性高糖及持续性高糖导致ATP合成减少可能与氧化应激有关。

　　综上所述，波动性高糖及持续性高糖可能通过氧化应激使ATP合成减少，且波动性高糖的程度更严重，最终导致INS-1细胞胰岛素分泌功能的损伤。这为以后改善ATP合成以减少β细胞高糖毒性提供更多的理论依据。但波动性高糖及持续性高糖使ATP合成减少的许多具体机制仍未证实，有待进一步的研究。