蛋氨酸诱导大鼠高同型半胱氨酸血症模型的实验研究

摘要：目的  探讨采用蛋氨酸不同途径诱导大鼠高同型半胱氨酸血症模型的效果。方法  雄性Wister大鼠24只，随机分为对照组、高蛋氨酸饮水组、高蛋氨酸饲料组，每组8只。高蛋氨酸饮水组与高蛋氨酸饲料组分别给予2%蛋氨酸饮水与2%蛋氨酸饲料喂养5周，观察各组大鼠每日平均进食量、每日平均进水量和体重增加量的变化；采用Elisa方法分别测定各组大鼠血清与血浆中的同型半胱氨酸浓度。结果  蛋氨酸饮水组与蛋氨酸饲料组血清与血浆中Hcy浓度均高于对照组（P＜0.05），而蛋氨酸饮水组与蛋氨酸饲料组差异无统计学意义（P＞0.05）。每日平均进食量为对照组与蛋氨酸饲料组均高于蛋氨酸饮水组（P＜0.05）；每日平均饮水量蛋氨酸饮水组与蛋氨酸饲料组均高于对照组（P＜0.05）。体重增加量为对照组高于蛋氨酸饲料组（P＜0.05）和蛋氨酸饮水组（P＜0.05）结论  采用高蛋氨酸饮水和高蛋氨酸饲料诱导大鼠高同型半胱氨酸血症模型，可得到一致性结果，相比而言采用饮水中添加蛋氨酸的方法较为简便和经济。

关键词  蛋氨酸；高同型半胱氨酸血症；模型；大鼠

Experimental Study of Build Homocysteine Model by Methionine in Rats  

Abstract: Objects To explore the effect of homocysteinaemia model. intake methionine In different ways in rats. Methods  24 male Wister rats , randomly divided into control group, high methionine water group, high methionine feed groups, each group of eight. High methionine water group and high methionine feed group were respectively 2% methionine water and 2% methionine feed 5 weeks, to observe the rat average daily food intake, average daily water inflow and the change of weight gain; determination of rat serum and plasma of homocysteine concentration by Elisa method. Results  Methionine water group and methionine feed group of serum and plasma Hcy concentration were higher than those in the control group (P < 0.05), methionine water group and methionine feed group difference was statistically significant (P > 0.05). Average daily food intake control group and methionine feed group is higher than methionine water group (P < 0.05); Average daily water quantity methionine water group and methionine feed group were higher than that in control group (P < 0.05). The change of weight gain control group are higher than the methionine feed group (P < 0.05) and methionine water group (P < 0.05)   Conclusion  Using high methionine water and high methionine feed rats induced homocysteine model, can get consistency results, compared with the method of adding methionine in drinking water is relatively simple and economic.

Keywords:  methionine, Homocysteine, Model, rats

高同型半胱氨酸血症是近年医学界热门研究内容之一，同型半胱氨酸(Homocysteine, Hcy )是蛋氨酸(Methionine,Met)代谢的中间产物，是腺苷蛋氨酸酶水解反应所生成的一种含硫基的氨基酸。越来越多的研究资料显示, 高同型半胱氨酸血症是心脑血管疾病的独立危险因素[1]，Hcy因此被称为能引起血管损伤、动脉粥样硬化和血栓栓塞性疾病的氨基酸[2]。目前通过蛋氨酸诱导的高同型半胱氨酸血症动物模型主要有3种方式，即通过蛋氨酸饲料喂养；蛋氨酸溶液灌胃；或蛋氨酸溶于动物饮水中建模。为探索更为有效、经济、简便易行的建模方法，我们进行了如下研究。

1  材料与方法

1.1  实验材料

蛋氨酸(methionine, Met)购自上海国药集团有限公司；同型半胱氨酸试剂盒购自BG公司；酶标仪为EX800型（产自美国Biotsx公司）。蛋氨酸饲料制作方法为正常大鼠饲料制备时添加2%蛋氨酸。

1.2 动物模型制备

选用雄性Wister大鼠24只，体重200-250g，购自青海省地方病防治研究所。适应性喂养1周后，随机分为3组，对照组、高蛋氨酸饮水组、高蛋氨酸饲料组，每组8只。高蛋氨酸饮水组给予2%蛋氨酸溶液作为饮用水；高蛋氨酸饲料组每日给予2%蛋氨酸饲料喂养。各组均自由进食、饮水，每日测定进食进水量。

1.3 血清和血浆中Hcy的测定

喂养5周后，从大鼠腹主动脉采血，各取2ml分别置于含有促凝剂的试管和含有肝素钠抗凝剂的试管中保存，均置于3000r/min 离心15分钟，取血清与血浆，采用ELISA法测定同型半胱氨酸含量，酶标仪测定波长为450nm。

1.4 数据处理

数据均以均数标准差(X±S)的形式表示,使用SPSS 11.5统计软件进行统计分析，统计方法为方差分析和配对t检验。

2结果

2.1各组大鼠每日平均进食量与每日平均进水量的变化

各组大鼠每日平均进食量的比较发现，对照组与蛋氨酸饲料组高于蛋氨酸饮水组（P＜0.05）；而对各组大鼠每日平均饮水量的比较，蛋氨酸饮水组与蛋氨酸饲料组均高于对照组（P＜0.05），同时，蛋氨酸饲料组高于蛋氨酸饮水组（P＜0.05）。结果详见图1、图2及表1。

2.2各组大鼠体重增加量的变化

对照组均高于蛋氨酸饲料组（P＜0.05）和蛋氨酸饮水组（P＜0.05），比较结果，见表1.

表1  各组大鼠平均每日进食量、平均每日进水量与体重增加量的变化(X±S)

注：★表示与对照组比较P＜0.05；◆表示与蛋氨酸饮水组比较P＜0.05。

2.3各组大鼠血清与血浆Hcy浓度变化

结果显示，蛋氨酸饮水组与蛋氨酸饲料组血清与血浆中Hcy浓度均高于对照组（P＜0.05），而蛋氨酸饮水组与蛋氨酸饲料组差异无统计学意义（P＞0.05），结果见表2。

表2  各组大鼠血清与血浆Hcy变化(X±S)

注：★表示与对照组比较P＜0.05；

3 讨论

有些研究认为蛋氨酸含量超过3%[3，4]时会出现毒性，故本研究使用2%蛋氨酸饲料，造模5周后，血清Hcy浓度达到19.80±7.24umol/L（大于15 umol/L为高Hcy血症[5]）；采用蛋氨酸饮水5周后血清Hcy浓度为22.08±5.73 umol/L，两组无统计学差异，说明两种方法均可得到一致性结果。

研究发现,蛋氨酸饮水组和蛋氨酸饲料组大鼠体重增加量均低于对照组，可见补充蛋氨酸后影响了体重增长，有研究认为是由于蛋氨酸的毒性作用造成的[6]，但从图1、图2可看出，蛋氨酸饮水组大鼠进食量始终处于较低水平，我们认为可能是由于蛋氨酸试剂本身具有的特殊性气味影响了大鼠的进水与进食量，从而造成体重增长变缓。

蛋氨酸饲料组建模过程中需要采用含有2%的特殊饲料，该饲料不易购得，自行制备较为不便，另外该饲料制作过程中需经过较长时间高压及烘制，可能会使蛋氨酸有效成分受到损失，相比较而言采用饮水中添加蛋氨酸的方法较为简便和经济。

有文献报道高同型半胱氨酸血症大鼠可采用蛋氨酸灌胃法建模[7,8]，实验中我们发现，如果按照蛋氨酸剂量1g/kg.d计算，体重为200g的大鼠每日灌胃量为0.2g，但由于蛋氨酸溶解度仅为3.3g/100ml水，无法将0.2g蛋氨酸溶于2ml水中，灌胃时蛋氨酸絮状沉淀会在注射器底部被压缩成片状，很难灌入胃中，故不建议采用蛋氨酸灌胃法建模。

促凝管血清中Hcy的测定结果显著高于抗凝管血浆中Hcy含量，与有关报道[9]一致。这可能与离心前从血液凝固到血清分离需要进行一段放置时间，使血细胞释放Hcy入血清有关。

参考文献：

[1] 胡奎.血清同型半胱氨酸的检测在心血管疾病中的临床价值[J].四川医学，2008，29（7）:916-917.

[2] 肖飞，郭健.血液中同型半胱氨酸的检测及意义[J].临床检验杂志，2000，18（1）:56.

[3] Pexa A, Herrmann M, Taban-Shomal O, eta.l Experi�mental hyperhom ocysteinaemiad ifferences in tissue m e tabo lites between homocysteine and methionine feeding in rat mode l[ J]. Acta Physio, 2009, 197: 27~ 34.

[4] Regina M, Korhonen VP, Smith TK, eta.l Methion inetoxicity in the rat in relation to hepatic accumulation of Sadensyl methionine prevention by dietary stimulation of the hepatic transsulfuration pathw ay [ J]. Arch Biochem Biophys, 1993, 300: 598 ~ 607

[5] Finkelstein JD, Martin JJ. Methionine metabo lism in mamma ls. Adaptation to methionine excess[ J ]. J Biol Chem. 1986, 261: 1582 ~ 1587.

[6] 孟斌, 高蔚娜, 杨继军等.高蛋氨酸饲料喂养的大鼠高同型半胱氨酸血症模型的实验研究[J]. 氨基酸和生物资源. 2011,33( 2 ):53~ 56

[7] 宋光熠, 姜雅秋, 张建军等. 苦碟子对高同型半胱氨酸血症大鼠过氧化及血管平滑肌增生的影响[J]. 中国老年学杂志, 2008,4(28):748-749.

[8] 陈凤英, 郭艳红, 高炜等. 高同型半胧氨酸血症对大鼠心室重塑的作用[J]. 北京大学学报（医学版）.2006,2(38):179-183

[9] 王永锋, 田宇. 同型半胱氨酸两种不同类型标本测定结果比较[J].实验医学与临床，2008，5(20)：1259-1260.