脂肪酶催化制备长短链甘油三酯的工艺研究

肥胖已成为世界范围内的首要健康问题，是导致几种慢性疾病的危险因素。能量摄入和能量消耗之间不平衡导致人体内的脂肪不断堆积，越来越多的人通过以低热量脂肪替代传统膳食脂肪来降低对高热量的摄入。结构脂质是一类由传统油脂改性而成的低热量油脂，具有特殊的脂肪酸组成和位置分布，能够在提供人体所必须的营养的同时，很好地降低热量。

长短链甘油三酯（Salatrim）以短链脂肪酸为酰基供体，易于吸收，不易堆积，是一种能代替普通油脂为人体供能的结构脂质。目前，国内外关于长短链甘油三酯的合成研究已不在少数。张晶等以三乙酸甘油酯和三油酸甘油酯在Lipozyme TL IM催化作用下，酯交换合成SLCTs，经优化条件实验后，长短链脂肪酸结构酯的产率达到76%。Cao等则利用茶籽油脂肪酸甲酯与三乙酸甘油酯进行酯交换反应，制备的 SLCTs 具有降低餐后血脂的功能。

丁酸（Butyrate acid，BA），俗称酪酸，是构成脂肪的一种脂肪酸，含有4个碳原子的短链饱和脂肪酸。丁酸对结肠壁细胞有多重保护作用，并可以延伸到结肠外，减少脂肪堆积、控制脂肪肝、降低血糖，对人体和大脑都有的健康作用。随着年龄的增长，人体内的肠道微生物大量减少，微生物发酵生成的丁酸不能满足肠道细胞的需要，肠道老化现象严重，这时补充外源性丁酸将有助于人体机能提升。多数研究以三丁酸甘油酯为原料，通过与天然油脂或脂肪酸甲酯酯交换制得长短链甘油三酯，或者直接以丁酸酸解催化油脂制得产物。如Han等用Lipozyme RM IM催化三丁酸甘油酯和硬脂酸甲酯的酯交换反应合成一种低热量的结构脂质。目标产品在最佳条件下经短程分子蒸馏后所显示的固体脂肪含量值类似于可可脂替代品、可可脂当量和可可脂，表明其应用于与其他脂肪包合作为可可脂替代品。Tsuzuki等研究了不同脂肪酶在有机溶剂体系下催化短链脂肪酸，如乙酸、丙酸和丁酸，与三油酸甘油酯进行酸解反应，发现丁酸更易插入三油酸甘油三酯中替代油酸。当前关于以丁酸乙酯为原料，通过酯交换制得长短链甘油三酯的工艺未见有报道。

本研究旨在在无溶剂介质中，通过脂肪酶催化大豆油和丁酸乙酯酯交换反应，以丁酸插入率为指标，探究合成长短链甘油三酯的最佳反应条件。本文在借鉴前人研究的基础上丰富了国内对大豆油改性制备低热量结构脂质的全面研究，进而促进了社会发展。

一、材料与方法

1.实验材料

大豆油（浙江益海嘉里食品工业有限公司）；丁酸乙酯（纯度＞98%，天津市科密欧化学试剂有限公司）；固体脂肪酶Novozyme 435（诺维信生物技术有限公司）；丁酸甲酯（上海Merck公司）；正己烷及其他有机试剂均为国产分析纯或色谱纯。

SHA-C数显水浴恒温振荡器（常州丹瑞实验仪器设备有限公司）；气相色谱仪（美国安捷伦公司）；BS224S电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；离心机（常州国华电器有限公司）。

2.实验方法

（1）长短链脂肪酸甘油三酯的制备与分离。制备：大豆油与丁酸乙酯的酯交换反应在无溶剂体系中进行，称取15g的大豆油与一定量的丁酸乙酯置与150mL的锥形瓶内，混合均匀，并加入一定量的固定化脂肪酶Novozyme 435，盖紧塞子，将其放在恒温水浴振荡器中，保持100r/min的振荡速率，在特定温度下反应4h后终止，过滤除去固体脂肪酶。

薄层层析法分离：选用100mm×200mm规格的硅胶板，对丁酸乙酯、大豆油和酶催化大豆油与丁酸乙酯合成的长短链甘油三酯产物进行TLC分析，参照标准谱图将对应的长短链甘油三酯条带刮下，用正己烷萃取2次，加入适量的无水硫酸钠，然后旋蒸除去正己烷。

（2）产物组成分析。采用气相色谱检测方法：称取0.1g样品，溶于10mL正己烷中，混合均匀后取1mL置于色谱瓶中进行气相分析。

气相色谱条件：色谱柱DB-1HT 毛细血管（29m×250μm×0.2μm）；载气N₂（纯度99.999%）；进样量1，进样口温度260℃，分流比20∶1；氢火焰离子化检测器，检测口温度380℃；氢气流量60mL/min，空气流量400L/min，尾吹气流量50mL/min。程序升温条件：温度80℃，保持2min；然后以10℃/min的升温速率持续加热至200℃，保持1min；再以30℃/min的升温速率加热至350℃，保持6min。

（3）脂肪酸组成分析。甲酯化方法：称取100mg分离后的产物，加入2mL 0.2mol/L的氢氧化钠-甲醇溶液快速混匀，再移取3mL的正己烷震荡30s，使之充分混合后，放入离心机离心2min，获得分层溶液，将上层透明澄清溶液用无水硫酸钠干燥，然后吸取上清液用于气相分析。

二、结果与讨论

1.产物组成分析。

产物甲酯化后的气相色谱图，对照各标准样品对产物谱图进行定性分析，丁酸甲酯保留时间2.119min，棕榈酸甲酯保留时间15.176min，硬脂酸甲酯保留时间16.642min，油酸甲酯保留时间16.905min，亚油酸甲酯保留时间17.383min，亚麻酸甲酯保留时间17.887min。根据图中数据可以看出，在本实验选定的反应条件下，图中未出现太多杂峰，且各脂肪酸甲酯的分离情况较好。

2.单因素实验结果分析。（1）反应时间对产物中长短链甘油三酯的影响。在丁酸乙酯与大豆油的摩尔比3∶1、反应温度50 ℃、加酶量为总底物的9%时，每次间隔2h进行一次产物取样，以探究制备长短链甘油三酯的最佳反应时间。

在不同反应时间下进行长短链甘油三酯的制备，丁酸的插入率发生了改变。在开始反应的10h内，随着时间的推移，反应速度加快，丁酸的插入率持续提升；在反应了10h时，丁酸的插入率已经达到了12.16%；而在反应了10h之后，丁酸的插入率反而下降了。这是因为酯交换反应是一个对峙反应，也可以用化学动力学平衡理论对这种现象进行解释。在反应早期，正向反应的速率快于反向反应的速率，因此丁酸插入率会不断增加。但是，随着反应的进行，反向反应的速率逐渐增加，正向反应的速率逐渐降低，最终达到动态平衡，这时反应的产物和反应物浓度不再发生变化，所以插入率也不再增加。而随着时间的推移，由于反向反应速率增加，丁酸插入率反而会下降。综合考虑，反应进行10h为最佳。在本实验的后续阶段将会把反应10h时的数据作为主要数据。

（2）加酶量对长短链甘油三酯含量的影响。在反应时间为10h、丁酸乙酯与大豆油的摩尔比为3∶1、反应温度为50℃的反应条件下，探究不同反应温度对制备长短链甘油三酯的影响。

在加酶量为3%～9%时，丁酸插入率随着加酶量的增加而增加，但在加酶量超过9%后，丁酸插入率反而随着加酶量的提升而降低。在反应初期，较高的加酶量会促进酶活性位点，提高反应速率，导致酰基供体的掺入量增加。同时这一时期，底物分子与酶分子的结合比较容易，酶底物复合物的形成速率较快，这就使得丁酸插入率随着加酶量的增加而提升。但当加酶量超过一定阈值时，丁酸插入率反而会随着加酶量的增加而降低，这是因为随着反应的进行，脂肪酶产生聚集，致使底物难以扩散，从而导致反应速率下降。为了降低生产成本并提高反应效率，加酶量控制在9%为最佳。

（3）反应温度对长短链甘油三酯含量的影响。在反应时间为10h、丁酸乙酯与大豆油的摩尔比为3∶1、加酶量为总底物9%时，探究不同反应温度对制备长短链甘油三酯的影响。

在反应温度为40～60℃时，丁酸插入率显著提升，根据Arrhenius定律，反应温度的升高通常导致由酶催化的加速效应。由于热力学平衡的移动，高温有利于反应正向移动，同时较高的温度降低了溶液的粘度，减少了传质限制，此时底物分子与酶分子之间的相互作用增强，酶与底物的结合力增加，使得酶底物复合物的形成速率提高。然而，当反应温度超过一定阈值时，酶会发生构象变化，酶分子的空间构型发生改变，酶的催化活性会受到影响；同时，温度升高也会加速酶的失活，降低酶的稳定性，使酶分子失去原有的催化能力，从而导致丁酸插入率开始降低。

（4）丁酸乙酯与大豆油的摩尔比对长短链甘油三酯含量的影响。在反应时间为10h、反应温度为60℃、加酶量为总底物的9%的反应条件下，探究丁酸乙酯与大豆油的不同摩尔比对制备长短链甘油三酯的影响。

酯交换反应是一个可逆反应，反应平衡是一个动态过程，这种平衡仅与起始反应物的浓度相关，即丁酸乙酯与大豆油的摩尔比。在丁酸乙酯与大豆油的摩尔比在1∶1至3∶1的范围内时，随着底物中丁酸的量不断上升，丁酸的插入率得到了显著提升；但是在丁酸乙酯与大豆油的摩尔比达到3∶1之后，丁酸插入率转为下降。这是因为在丁酸乙酯与大豆油的摩尔比在1∶1至3∶1的范围内时，丁酸量的增加可以提高丁酸在化学反应中的浓度，从而促进丁酸的插入率。但当丁酸乙酯与大豆油的摩尔比超过3∶1时，丁酸乙酯的浓度占据了主导地位，丁酸的浓度相对降低，从而导致丁酸的插入率下降。综合考虑，选择丁酸乙酯与大豆油的摩尔比为3∶1最合适。

三、结论

以丁酸乙酯和大豆油为原料，固体脂肪酶Novozyme 435为催化剂，探究了反应时间、反应温度、加酶量和底物比率对大豆油中丁酸插入率的影响。探究结果表明：在反应时间为10h、反应温度为50℃、加酶量为9%、丁酸乙酯与大豆油的摩尔比为3∶1时，大豆油中丁酸的插入率最高。

文章来源：  《中国食品》  https://www.zzqklm.com/w/qt/29400.html