基于磷脂基紫杉醇纳米前药的抗肿瘤应用研究

化疗在肿瘤的临床治疗中发挥着不可或缺的作用[1,2]. 由于肿瘤的异质性和微环境的复杂性，临床化疗的治疗效果并不理想[3,4]. 大多数化疗制剂具有快速的药代动力学和非特异性的药物分布，活性药物在肿瘤的蓄积量很低，且治疗过程伴随着严重的全身毒性[5~7]. 为了解决上述问题，一系列药物辅料，如聚合物[8,9]、磷脂[10,11]、蛋白质[12,13]和基因[14,15]等，被用作载体构建纳米递送体系. 药物的溶解性在很大程度上得到了提高，且纳米的尺寸效应有利于延长药物在体内的循环时间，促进药物在肿瘤组织蓄积[16~18]. 然而这些纳米药物普遍存在载药量低、药物释放不可控的问题[19]. 大量辅料的使用也增加了不必要的代谢负担和免疫毒性的风险[20]. 前药型纳米药物有望解决上述难题.

前药是通过化学修饰原药分子得到的一类没有药物活性的分子[21]. 需在特定的刺激下释放出原药分子才能发挥抗癌疗效[22,23]. 肿瘤具有特异性微环境，如氧化还原物质含量高、微酸、乏氧和高表达多种特异型酶等，这为构建肿瘤微环境响应的前药提供了有利的条件[24~26]. 设计合成响应型前药，有利于药物在肿瘤精准释放，进而实现纳米药物对肿瘤细胞的特异性杀伤[27,28]. 二聚体前药是由2个相同的药物分子桥连而成，能够自组装形成稳定的纳米颗粒[29]. 二聚体前药策略能够显著提高制剂中的药物含量，我们课题组报道了一系列氧化还原[6,30]、酶[31]和乏氧[32]响应的紫杉醇二聚体前药. 考虑到药物的体内高效递送，加入载体材料提高纳米药物的循环稳定性是必要的.

脂质体具有类细胞膜结构，具有较好的生物相容性和较高的药物递送效率[33]. 临床上就有脂质体-紫杉醇(Lipusu)[34]，脂质体-阿霉素(Doxil)[35]等制剂被成功开发和应用. 磷脂作为脂质体的重要组成部分，其双亲的结构使其在药物组装和体内递送方面具有独特的优势[36,37]. 两性离子的结构对抑制蛋白吸附和维持体内循环稳定性起着非常关键的作用[38,39]. 然而，亲水部分结构和所带电荷对药物递送的影响并不清楚. 阐明不同结构磷脂对药物组装、稳定性、细胞毒性、体内分布和抗肿瘤效果等方面的影响，有助于开发性能优异的磷脂型纳米递送体系. 基于此，我们以紫杉醇二聚体为模型药物，以不同结构的磷脂分子为药物载体，构建了磷脂基刺激响应药物递送体系. 如图1所示，2种磷脂载体，磷脂酰胆碱DPPC和聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺DSPE-PEG，和紫杉醇二聚体(PTX2-SS)通过纳米沉淀的方法组装制备成纳米紫杉醇药物，得到的PTX2-SS@DPPC NPs和PTX2-SS@DSPE-PEG NPs分别命名为DcP NPs和DeP NPs. 我们深入研究了磷脂辅料对紫杉醇纳米剂型的物理化学性质和递送效率的影响.

Fig. 1  The schematic illustration of the formation of DeP NPs and their in vivo drug delivery.

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1 实验部分

1.1 主要原料

紫杉醇(PTX)购自大连美伦生物科技有限公司. 4-二甲氨基吡啶(DMAP)购于阿拉丁科技(中国)有限公司. 亚二硫基二乙酸购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司. 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)购自上海源叶生物科技有限公司. 超纯水由Milli-Q系统(Millipore，USA)制备. 1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚(乙二醇) (DSPE-PEG)购于上海芃硕生物科技有限公司. 1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DPPC)购于萨恩化学技术(上海)有限公司. 细胞培养皿、离心管均购于耐思生命科技股份有限公司. 6孔板和96孔板均购买于广州洁特生物过滤股份有限公司. Calcein/PI细胞活性与细胞毒性检测试剂盒和抗体法微管红色荧光探针(Tubulin-Tracker Red)购于上海碧云天生物科技有限公司.

1.2 PTX2-SS的合成

根据我们之前的工作合成了2,2'-二硫代二乙酸桥连的PTX二聚体(PTX2-SS)[8].

1.3 DeP NPs的制备

将质量比为1:3的PTX2-SS与DSPE-PEG溶于4 mL四氢呋喃(THF)中. 在室温条件下，将上述THF溶液缓慢地滴入10 mL超纯水中. 室温搅拌，并用去离子水透析，直至THF完全除去. 以3500 r/min的转速离心5 min，去除未组装的PTX2-SS和DSPE-PEG，即可得到DeP NPs. DPPC和PTX2-SS的组装操作和上述相同，不同地，当有机溶剂挥发完全后，得不到均匀的纳米颗粒.

1.4 胶体稳定性测试

将DeP NPs与含10%胎牛血清(FBS)的PBS、无血清的RPMI-1640培养基和葡萄糖(GLU)溶液在室温下共同孵育不同时间，用动态光散射(DLS)测定纳米药物的尺寸变化.

1.5 PTX2-SS与载体的组装驱动力

在37 ℃下，将DeP NPs与NaCl、尿素(Urea)和聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)振荡孵育12 h. 采用DLS测定粒径和多分散系数(PDI)的变化.

1.6 DeP NPs的H2O2响应性药物释放

将NPs (含30 μg PTX2-SS)置于500 μL的释放介质(PBS (pH=7.4)/乙醇 = 7/3 (V/V)，含10 mmol/L H2O2)中，在37 ℃下孵育不同时间后，将500 μL乙腈加入上述释放液. 1×104 r/min高速离心6 min后，取上清，并利用高效液相色谱(HPLC)检测NPs的氧化响应性药物释放，其中，检测波长设置为231 nm.

1.7 细胞系和细胞培养

L929 (小鼠成纤维细胞) 和HeLa (人宫颈癌细胞)在含10%FBS (GIBCO)的DMEM培养基(GIBCO)中培养，4T1 (小鼠乳腺癌)细胞株在含10%FBS (GIBCO)的RPMI-1640培养基(BI)中培养. 细胞在37 ℃和5% CO2的培养箱中培养，每天更换一次培养基.

1.8 用CLSM测定细胞摄取

用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)测定细胞对BDP@DeP NPs的摄取情况. 首先，将4T1细胞接种在六孔培养板中(每孔2×105个细胞)，在37 ℃下，孵育24 h使细胞贴壁. 然后，将培养液吸出，加入用RPMI-1640培养基稀释的BDP@DeP NPs，每孔加入1 mL，其中BDP浓度为0.1 μg·mL-1. 分别在37 oC下孵育0.5和2 h，在4 ℃下孵育2 h后，将NPs吸出，随后用Hoechst 33258染色细胞核，染色时间为5 min，最后用CLSM对细胞成像. 溶酶体共定位实验大致操作相同，区别是用BDP@DeP NPs孵育细胞2 h后，需用Lyso-Tracker Green染色溶酶体30 min，用于定位细胞内的溶酶体. HeLa细胞的摄取测定操作大致相同，区别是加入纳米药物后，孵育细胞的时间为3 h.

1.9 细胞活性测定

通过MTT法检测NPs对不同细胞的细胞毒性. 首先，用100 μL RPMI-1640/DMEM培养基以2×103细胞/孔的密度在96孔板中接种肿瘤/正常细胞. 孵育24 h后待细胞贴壁，将培养基吸出，替换为100 μL用RPMI-1640/DMEM培养基稀释的NPs和Taxol，同时设置加入空白培养基的对照组. 待细胞孵育48 h后，每孔加入20 μL MTT (5 mg·mL-1)，在37 ℃下孵育额外的4 h. 然后，小心地将培养基吸出，每孔加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)用于溶解形成的紫色甲瓒晶体. 最后，将96孔板振荡3 min，用酶标仪检测紫色产物在490 nm处的吸光度.

1.10 Calcein-AM/PI染色实验

用Calcein-AM和PI染色细胞，能够区分死细胞(红色荧光)和活细胞(绿色荧光). 用相同PTX浓度(40 μmol/L)的Taxol和DeP NPs在37 ℃下孵育4T1细胞60 h后，吸出培养液，加入Calcein-AM/PI染色液，在室温下避光孵育30 min. 最后，用荧光显微镜对处理后的细胞进行成像.

1.11 微管染色实验

用相同PTX浓度(30 μmol/L)的Taxol和DeP NPs孵育4T1细胞24 h后，吸出培养液，用4%的多聚甲醛固定细胞12 min，然后用含0.1% Triton X-100的PBS (pH=7.4)溶液清洗细胞2次. 再用含有0.1% Triton X-100和3%牛血清白蛋白(BSA)的PBS (pH=7.4)溶液稀释的微管蛋白免疫染色二抗孵育细胞，室温避光染色30 min. 最后，用CLSM成像细胞的微管.

1.12 活体荧光成像和动物抑瘤实验

所有动物实验均经中国科学院长春应用化学研究所动物福利与伦理委员会批准(No. 2022-0006). 雌性Balb/c小鼠购于辽宁长生生物技术有限公司，并在规定条件下饲养.

(1) 构建皮下小鼠乳腺癌异体移植瘤作为动物模型，研究DeP NPs的生物分布. 将4T1细胞皮下接种于小鼠右前肢外侧，每只接种2×106个细胞. 在肿瘤达到合适大小后，小鼠(n=3)分别经尾静脉给药IR@DeP NPs，注射后于1、6、12、24、36和48 h采集体内近红外荧光图像. 然后处死小鼠，对离体器官和肿瘤成像.

(2) 构建皮下小鼠乳腺癌异体移植瘤作为动物模型，评价DeP NPs的抗肿瘤疗效. 具体地，将4T1细胞皮下接种于小鼠左前肢外侧，每只接种2×106个细胞. 待肿瘤长到50~100 mm3，将荷瘤小鼠随机分为3组(n=5)：(1) PBS (空白对照)、(2) Taxol、(3) DeP NPs. 治疗前，对小鼠进行标记、称重和瘤径测量. 分别在第0、2、4、6、9天，给相应荷瘤小鼠静脉注射PBS、Taxol和DeP NPs，注射PTX剂量为15 mg·kg-1 (药重/体重). 在第0、2、4、6、8、10、12、14、16天测量小鼠体重和肿瘤体积. 第17天安乐处死小鼠，解剖出肿瘤，用于更直观地评价纳米制剂的抑瘤效果. 为了评价药物的安全性，同时测定了血常规. 并采集主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)和肿瘤，用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋、切片，进一步用苏木精和伊红(H&E)染色，评估主要脏器潜在毒性和癌细胞凋亡程度.

2 结果与讨论

2.1 磷脂基前药纳米粒子的制备和表征

首先使用纳米沉淀的方法将DPPC和DSPE-PEG分别与PTX2-SS组装制备纳米材料. 结果发现，PTX2-SS和DPPC难以形成稳定的纳米颗粒，大部分以沉淀的方式析出 (电子支持信息图S1)；而PTX2-SS与DSPE-PEG可以得到均匀的纳米颗粒(命名为DeP NPs). 如图2(a)和2(b)所示，利用DLS对纳米粒子的水合粒径和表面电位进行了表征. DeP NPs的平均粒径为201.1 nm，且带负电，ζ电位为-13.8 mV，从图2(c)所示的透射电镜(TEM)图中可以看出，DeP NPs形成了具有纳米尺寸的规则胶束形貌. 如图2(d)所示，在无血清RPMI-1640培养基、含10% FBS的PBS(pH=7. 4)和5% GLU溶液中检测了DeP NPs的胶体稳定性. 在24 h内，DeP NPs显示出可忽略的尺寸变化，证实了其较好的胶体稳定性. 为了阐明磷脂载体和PTX2-SS组装的驱动力，分别用氯化钠(NaCl)、尿素(urea)和聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)处理DeP NPs. 如图2(e)所示，Triton X-100处理使DeP NPs颗粒尺寸明显减小，PDI增加，证实了疏水相互作用在组装过程中起主导作用. 这些结果表明，DeP NPs具有较好的胶体稳定性.

Fig. 2  (a) Size distribution, (b) ζ-potential, and (c) TEM image of DeP NPs. (d) Stability detection of DeP NPs in the presence of PBS solution containing 10% FBS, serum-free RPMI-1640 and 5% glucose solution. (e) The changes of size and PDI of DeP NPs after treatment with deionized water, NaCl, urea and Triton X-100 solutions.

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2.2 DeP NPs的氧化响应型药物释放

前药的响应性药物释放对其发挥抗肿瘤作用至关重要. 因此，我们利用10 mmol/L的过氧化氢(H2O2)模拟肿瘤细胞内氧化微环境，采用HPLC监测DeP NPs的药物释放行为. 如图3(a)和3(b)所示，在H2O2存在的情况下，DeP NPs中的前药发生了降解，同时生成了PTX，且PTX的释放展现了时间依赖性. 根据我们之前的研究，具体的释放机理可能为：PTX前药先被H2O2氧化成亚硫砜或硫砜，并进一步水解生成PTX[8].

Fig. 3  (a) The HPLC analysis of PTX release from DeP NPs treated with 10 mmol/L H2O2. (b) The corresponding PTX release curves of DeP NPs in the presence of 10 mmol/L H2O2.

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2.3 DeP NPs的细胞摄取

进一步利用氟硼二吡咯(BDP)标记纳米粒子，研究其在胞内的分布情况. 将DSPE-PEG和BDP、PTX2-SS共组装，得到BDP@DeP NPs. 如图4(a)所示，和游离的BDP相比，BDP@DeP NPs的最大吸收波长红移了约10 nm，表明BDP以聚集组装形式存在. 和BDP小分子相比，纳米颗粒的荧光淬灭也再次证实了BDP在纳米粒中的聚集状态，说明BDP分子已经被成功地担载进DeP NPs中(图4(b)). 在37 ℃下，将4T1细胞与BDP@DeP NPs孵育不同时间(0.5和2 h)，并通过CLSM观察细胞内的荧光. 如图4(c)所示，随着孵育时间的增加，从0.5~2 h，胞内荧光强度逐渐增强，表明BDP@DeP NPs可以被细胞成功内吞，且内吞呈现时间依赖性的增强. 同样的内吞行为在HeLa细胞中也被验证(电子支持信息图S2). 此外，从图4(c)中可以看出，与37 ℃相比，4 ℃的孵育条件下，4T1细胞内的红色荧光强度明显降低，这表明内吞作用是能量依赖的. 我们进一步使用溶酶体绿色荧光探针标记细胞的溶酶体. 如图4(d)所示，红色荧光和绿色的荧光高度重叠，共定位系数为0.93，表明纳米粒子是通过内涵体和溶酶体途径进入细胞.

Fig. 4  (a) The absorption and (b) fluorescence spectra of free BDP and BDP@DeP NPs at the same BDP concentration. (c) CLSM images of 4T1 cells treated with BDP@DeP NPs at different incubation time and temperature. (d) Co-localization with lysosome of BDP@DeP NPs after being internalized by 4T1 cells for 2 h. (e) Corresponding fluorescence coincidence curves of NPs and lysosomes.

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2.4 DeP NPs的细胞毒性评价

接着采用噻唑蓝(MTT)实验对DeP NPs的细胞毒性进行评估. 在37 ℃下，将4T1细胞分别与相同PTX浓度的Taxol和DeP NPs孵育48 h. 如图5(a)所示，DeP NPs展示了较高的细胞抑制活力，在30 μmol/L的浓度下即可使4T1细胞生存力降至50%以下，这表明纳米粒在细胞内可成功释放PTX，进而杀死肿瘤细胞. 我们注意到，纳米粒组的细胞毒性不如游离药物，这可能是因为前药在48 h的孵育时间内未完全释放出原药分子. 考虑到肿瘤细胞和正常细胞内氧化还原剂含量的差异，我们探究了纳米粒对正常细胞(L929)的毒性. 结果如图5(b)所示，Taxol对L929和4T1的细胞毒性几乎一致，而DeP NPs对L929的细胞毒性明显降低，即使在的浓度50 μmol/L下，细胞抑制率也不到50%，这说明DeP NPs可以部分选择性杀伤肿瘤细胞. 接下来，使用活死细胞染色实验更直观地观察各剂型的细胞毒性. 如图5(c)中的荧光显微镜图像所示，与PBS组细胞相比，DeP NPs处理组细胞内产生了明显的红色荧光，这也与MTT实验的结果一致. PTX可以通过与β-微管蛋白特异性结合来抑制微管蛋白解聚，从而导致细胞有丝分裂功能障碍，诱导细胞凋亡. 本文通过微管的免疫荧光染色实验探究PTX前药制剂的抗肿瘤机制. 如图5(d)所示，未加药组4T1细胞具有明显的微管网络结构，而用含PTX的纳米前药和Taxol处理的细胞则会引起不同程度的微管聚集. 这说明了DeP NPs可以在胞内释放出活性PTX.

Fig. 5  Cytotoxicity of Taxol, DeP NPs against 4T1 (a) and L929 cells (b). (c) Fluorescence microscope images of live and dead 4T1 cells after incubation with Taxol and DeP NPs (PTX concentration: 40 μmol/L). (d) The morphological changes of microtubules of 4T1 cells after incubation with Taxol and DeP NPs (PTX concentration: 30 μmol/L) for 24 h.

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2.5 DeP NPs的体内生物分布

采用近红外染料IR-780标记DeP NPs，并构建小鼠乳腺癌4T1异体移植瘤动物模型，用于研究DeP NPs的体内生物分布和肿瘤蓄积情况. 首先将DSPE-PEG，与IR-780和PTX2-SS共组装，得到同时担载IR780和PTX2-SS的IR@DeP NPs. 如电子支持信息图S3(a)所示，和游离的IR-780相比，IR@DeP NPs的紫外吸收光谱峰形变宽，表明IR-780以聚集组装形式存在. 和IR-780小分子相比，纳米颗粒的荧光淬灭也再次证实了IR-780在纳米粒中的聚集状态，说明IR-780分子已经被成功地担载进DeP NPs中(电子支持信息图S3(b)). 将得到的纳米制剂通过尾静脉注射到小鼠体内，并使用活体成像系统实时监测药物在体内的分布. 在注射药物后48 h，将小鼠处死，并收集其主要的器官(心、肝、脾、肺和肾)和肿瘤，进行离体荧光成像. 如图6(a)所示，DeP NPs组的小鼠，在给药1 h后其肿瘤内即呈现明显增强的荧光信号，且在48 h内该信号仍保持在相对较高的水平. 如图6(c)所示，荧光强度的半定量柱状图进一步表明了DeP NPs较多的肿瘤蓄积. 从图6(b)和6(d)可以看出，DeP NPs在肝和脾蓄积较少，而在肿瘤内的蓄积较多. 证实了DSPE-PEG作为载体递送紫杉醇前药的优势.

Fig. 6  (a) The in vivo NIR fluorescence images of 4T1 cells-suffering mice after intravenous injection of IR@DeP NPs and (b) the corresponding isolated organs and tumor tissues collected at 48 h post-injection. He, Li, Sp, Lu, Ki, Tu represent heart, liver, spleen, lung, kidney and tumor, respectively. Semi-quantitative analysis of fluorescence intensity of tumor in vivo (c), and isolated main organs and tumor (d) (n=3).

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2.6 DeP NPs的体内抑瘤效果和生物安全性

采用4T1异体移植肿瘤模型来评估不同纳米药物的抗肿瘤功效. 动物实验方案如图7(a)所示，在注射4T1肿瘤细胞6天后，将荷瘤小鼠随机分为3组：PBS、Taxol和DeP NPs组，给小鼠以15 mg·kg-1的PTX剂量静脉注射Taxol和DeP NPs，同时测量记录小鼠的肿瘤体积和体重. 系统给药5次后，在第17天，将小鼠处死. 如图7(b)所示，PBS组小鼠的肿瘤生长迅速，而DeP NPs和Taxol组的肿瘤生长速度明显下降. 在治疗13天后，DeP NPs和Taxol组小鼠的肿瘤生长受到了有效地抑制. 离体肿瘤的照片和质量进一步证实了DeP NPs具有较好的体内抑瘤效果(图7(c)~7(d)). 如图7(e)所示，采用苏木精-伊红(H&E)染色法对离体的肿瘤进行切片染色，DeP NPs组肿瘤切片展示出较多的细胞核消融. 上述结果均证实了DeP NPs具有可媲美Taxol的体内抑瘤效果.

Fig. 7  (a) The detailed procedures of the animal treatment. (b) The monitoring of tumor volume of 4T1-suffering mice after intravenously injected with PBS, Taxol, and DeP NPs. (c) Photographs and (d) weight of isolated tumors collected from mice after different treatments, including PBS, Taxol, and DeP NPs. (e) The H&E staining images of resected tumors in the PBS, Taxol, and DeP NPs groups. Statistical P-values: n.s., no significance, **P<0.01, ***P<0.001.

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  接着对药物的生物安全性进行了考察. 如图8(a)所示，在治疗期间，各组小鼠体重均无较大变化. 血常规数据显示：治疗组除Taxol组的血小板(PLT)有所升高外，均与对照组相差不大 (图8(b)). H&E染色结果也再次证实了DeP NPs并未对主要器官组织造成损害(图8(c))，在当前的剂量下，DeP NPs没有产生明显的全身毒性.

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Fig. 8  (a) The body weight of mice after intravenously injected with PBS, Taxol and DeP NPs. (b) Blood routine analysis of mice in PBS, Taxol and DeP NPs groups (n=4). (c) H&E staining images of main organs collected from mice in PBS, Taxol and DeP NPs groups.

3 结论

本文表征了磷脂基载体DPPC和DSPE-PEG担载紫杉醇二聚体，对组装体的结构、响应性、体外细胞毒性、体内抗肿瘤作用和生物安全性的影响. 研究表明：DPPC不利于PTX二聚体的组装，DSPE-PEG能形成均匀的纳米前药，得到的DeP NPs展示了氧化响应的药物释放、有效的细胞毒性、较多的肿瘤蓄积和可媲美Taxol的抗肿瘤活性. 总之，用于担载药物的载体材料对于提高纳米药物的递送效率十分重要，该工作可为开发磷脂基纳米药物及其潜在的临床应用提供重要指导.