吲哚-2,3-二酮（ISA）对小鼠骨髓细胞微核和染色体的影响

吲哚-2,3-二酮（ISA）亦称2,3-吲哚醌，又名靛红，系天然存在的吲哚类化合物，存在于人体和中药青黛以及大青叶中, 是目前国内自行研制开发的Ⅰ类抗癌新药靛玉红化学二聚体结构的单体。该物质也存在于龙虾体内，是龙虾生存所必需的一种天然海洋活性物质[1] 。通过我们的前期研究工作表明，ISA有促进人和小鼠神经母瘤细胞凋亡的作用[2] 。本文在此工作基础上进一步研究ISA对小鼠骨髓细胞微核和染色体的影响，更深入探讨其作为抗癌新药的安全性。

1、材料与方法

1.1试剂与动物：吲哚-2,3-二酮(青岛大学药理教研室)； 秋水仙素 (PH0025, Sigma)， 甲醇(AR)，冰醋酸(AR)，0.075％KCl(AR)溶液，小牛血清、Giemsa 储备液、 pH 6.8磷酸盐缓冲液。昆明种小鼠(二级),♀、♂各半，体重18～22g，由河北医科大学实验动物中心提供，合格证号：冀医动字04056。

1.2方法： 

1.2.1小鼠分组方式及骨髓细胞微核染毒试验：选定50只小鼠，随机分为数量均等的5组，随机确定阴阳对照组各一个，实验组三个；阳性对照组给予环磷酰胺20mg.kg-1.d-1，阴性对照组给予生理盐水，实验组中分低、中、高三种ISA剂量，分别给予ISA20, 60, 180 mg.kg-1 .d-1，腹腔注射，连续4d，第5天各组分别于24h、48h和72h取样。

1.2.2小鼠骨髓细胞微核标本制备及分析：采用颈椎脱臼处死小鼠，速剪取其胸骨，剔去肌肉，用干净纱布擦拭，剪去每节骨骺端，用止血钳挤出骨髓液，点在载玻片一端预先滴好的小牛血清中。混匀后推片。甲醇固定15min,Giemsa应用液染色15min，冲洗染色液，晾干。

观察计数：依次经低倍镜、高倍镜粗检后，选择细胞分布均匀、形态完整、染色良好的区域镜检，然后在油镜下按一定顺序进行微核计数，计数1000个PCE中含微核的PCE均值数，并且注意200个细胞中PCE与NCE的比值。

1.2.3小鼠骨髓染色体畸变试验染毒模型和分组：小鼠随机分组,染毒方法同上。腹腔注射，连续4天，并在第4天染毒结束6小时之后取材。 

1.2.4小鼠骨髓染色体标本的制备：按2μg/g体重的剂量，经腹腔向小鼠体内注射秋水仙素，2.5h后用颈椎脱臼的方法将小鼠处死， 取出完整股骨并擦净， 7ml生理盐水冲洗股骨髓液于离心管中，反复数次至骨髓发白,以1500r/min转速，离心分离8min。去清液后加入37℃的0.075mol/L KCl溶液6ml，混合均匀，置于37℃的恒温水浴中保温15min，再加固定液1.5ml左右，摇匀并静止少许,以1000r/min转速离心分离10min。去清液后，加入新配制固定液5ml,充分混合，室温下静置15min，再以1000r/min的转速离心10min，去清液。以同样方法重复固定一次。留约0.5ml沉淀物，加0.2ml新固定液,混合均匀,得到细胞悬浮液。取少量细胞悬液滴于干净湿冷的玻片上，轻轻吹散并干燥，在玻片标本上滴加Giemsa染液，染色15min，用纯净水缓缓冲去染液至干净，晾干。在低倍镜下按一定顺序选择背景清晰、分散良好、染色收缩适中的中期分裂相细胞，用油镜进行分析, 小鼠染色体数目2n=40，每个标本观察80个，分析其染色体结构，确定畸变数目，计算畸变率。

1.2.5分析统计方法：采用SPSS 11.5软件对试验结果进行方差分析。

2、结果

2.1吲哚-2,3-二酮对小鼠微核的影响：每组小鼠按性别不同分别计算微核PCE的均值，结果显示无明显的性别差异，因此可合并计算结果。从计算结果可见，三种不同剂量的ISA微核形成率分别与阴性对照组比较，其差异并不显著（P>0.05），而与阳性对照组比较，无论是三种不同剂量的ISA，还是阴性对照组，其差异则十分显著（P<0.001）

ISA对小鼠微核（PCE）的影响（x±s‰）

组别            受检细胞数	剂量（mg·kg-1）	24h	48h	72h
盐水阴性对照         1000		1.65±0.5	2.13±0.8	2.91±0.7
环磷酰胺阳性对照     1000	20	8.33±2.1*＃	14.5±3.0*＃	23.0±6.0*＃
ISA小剂量            1000	20	1.78±0.8	2.3±0.9	3.2±1.1
ISA中剂量            1000	60	1.8±0.6	2.5±0.9	3.7±1.2
ISA大剂量            1000	180	2.2±0.9	3.0±1.0	3.8±1.3

* 与阴性对照组比较P<0.001，＃与ISA剂量组比较P<0.001，

2.2 200个细胞中PCE与NCE的比值：三个ISA剂量组PCE/NCE比值均在0.71±0.2范围内，与阴性对照比较差异无显著性（P>0.05）。而与阳性对照组的0.082±0.01均值比较，则差异有显著性（P<0.01）。

2.3 ISA对小鼠染色体畸变的影响：见表2所示：

表2  ISA诱导鼠细胞染色体畸变情况

实验 分组	细胞总数	数目畸变 细胞数	结构畸变 细胞数	染色体畸 变总数	畸变率 （%）
盐水对照组	80	3	2	5 25 6	6.2±1.7 31.3±3.8*＃ 7.5±1.9
环磷酰胺组	80	18	7
ISA组	80	5	1

*与阴性对照组比较P<0.01，＃与ISA剂量组比较P<0.01

3、讨论

近年来已建立许多测定细胞遗传损伤的短期试验，微核试验(Micro-nucleus Test)就是其中之一。一切进行分裂的细胞，在染色体断裂剂或能影响纺锤体的毒物作用下均产生微核。故利用微核试验可对药物导致染色体损伤的情况进行测定。

微核可出现在多种细胞中，且在有核细胞中较难与正常核的分支相区别，由于红细胞在成熟前最后一次分离后数小时可将主核排出，而仍保留微核于PCE细胞中，因此，计数PCE细胞中的微核数，便能检测因化学毒物或物理因素诱导产生的染色体完整性改变，以及检测染色体分离改变这两种遗传学终点。

红细胞的细胞增殖动力学显示，其排核成为PCE后，通常在骨髓中停留约2～24h之后而入血[3] 。由于染毒次数及取样时间不同，化学毒物诱发微核出现的高峰时间也不尽相同，波动范围往往可以达到24h～72h，所以要求在接触化学毒物后设立不同的采样时间点。本次微核试验采用了不同时间段取样三次，结果显示各组的微核形成率均表现为：72h>48h>24h，这与微核形成时相变化过程相符。而环磷酰胺组的微核形成率明显高于阴性对照和ISA剂量组（P<0.001），表明其较强的遗传毒性作用。高、中、低三种ISA剂量的微核率与阴性对照无明显差异（P>0.05），同时PCE与NCE的比值均在正常范围内，提示ISA无毒性。

基因突变和染色体畸变的检测直接反应了化学毒物的致突变性，是评价化学毒物致突变性唯一可靠的方法。当染色体发生畸变时， 则会导致基因在位置及数量上发生改变,基因间的平衡性即被打乱[4] 。本文在进行微核试验的同时亦进行了染色体核型分析，旨在比较两种试验结果的一致性。结果显示环磷酞胺能诱发小鼠染色体畸变， 染色体畸变以数目异常占多数，主要表现为单价单体，结构畸变表现为断裂和易位现象，而阴性组和ISA组少有畸变，说明环磷酞胺致染色体损伤的遗传效应[4] 。环磷酞胺组畸变率与ISA不同剂量组以及阴性对照组相比有显著性差异，而ISA不同剂量组组与阴性对照组比较则无显著差异（P>0.05）。

总之， ISA对小鼠骨髓细胞微核和染色体的影响研究未见文献报道，本文的结果表明ISA的无遗传诱导毒性，为ISA药物安全性提供了参考。