丙型肝炎病毒核心蛋白对胆管癌细胞NFAT1基因表达的影响

丙型肝炎病毒核心蛋白对胆管癌细胞NFAT1基因表达的影响

廖巧芳1  李志花1   陈汝福2   郭宁2   曾兵2   程帝1  郑礼平1

（1．肿瘤科2．肝胆外科，中山大学孙逸仙纪念医院 广东广州 510120）

（1．Department of Oncology，2．Department of Hepatobiliary Surgery，Sun Yat-Sen Memorial Hospital，Sun Yat-Sen University，Guangzhou 510120， China）

摘要：目的 探讨丙型肝炎病毒核心蛋白（HCV C）是否通过调控转录及炎症因子NFAT1的表达参与肝内胆管癌的发展及恶性生物学行为。方法 构建表达HCV C核心蛋白的真核表达质粒pEGFP-N₃-HCV C，通过瞬时转染pEGFP-N₃-HCV C质粒，qRT-PCR检测肝内胆管癌RBE细胞中NFAT1 mRNA的表达，Western blot检测NFAT1蛋白的表达，MTT法检测细胞增殖，流式细胞仪检测细胞周期。结果 转染HCV C后胆管癌细胞NFAT1基因的mRNA及蛋白表达明显上升，差异具有显著性（P<0.05）；HCV C能够促进细胞向G2/M期进展及促进细胞增殖。结论 HCV C上调胆管癌细胞中NFAT1基因的表达，促进细胞周期进展及胆管癌细胞增殖，可能与肝内胆管癌的发展有关。

关键词：人胆管癌细胞RBE,HCV C ,NFAT,细胞周期，细胞增殖

The effect of hepatitis C virus core gene transfection on expression of nuclear factor of activated T cells one in human   biliary carcinoma cell lines

Abstract:Objective To explore the effect of hepatitis C virus core protein (HCV C) on the regulation and inflammation of the NFAT1 transcription factor expression in the intrahepatic bile duct carcinoma .Methods The recombinant plasmid(pEGFP-N₃-HCV C) and the vector alone were cotransfected with enhanced green fluorescent protein( EGFP) into RBE cells using liposome. The real time RT-PCR and Western blot were used to show the expression of NFAT1 mRNA and protein.Results After HCV C transfection, the expressions of NFAT1 mRNA and protein in RBE Cell were enhanced(P<0.05).Conclusion HCV C gene transfection upregulates the transcriptional expression of NFAT1 mRNA in biliary carcinoma cells, it is suggested that HCV C protein contributes to virus carcinogenesis.

Key words: human  biliary carcinoma cell lines RBE, Hepatitis C virus core protein, nuclear factor of activated T cells NFAT,cell cycle ,cell proliferation

    丙型肝炎病毒核心蛋白（HCV C）通过与细胞蛋白的结合，对细胞信号转导、基因表达调控及宿主的免疫等多个方面起到调节作用。在这过程中，转录因子NF-κB、AP-1、Sp-1、STAT3等通过不同的途径被激活^[1]。近年来,转录及炎症因子NFAT家族在肿瘤细胞中的作用受到越来越多的重视，已有研究证实NFAT亚型在乳腺癌^[2]、结肠癌^[3]、胰腺癌^{[4], [5]}中的表达增高，而且在肿瘤的侵袭、分化、存活甚至血管形成及肿瘤微环境中都起着一定的作用。为了探讨HCV C可能的致癌机制，本实验通过探讨HCV C是否上调胆管癌RBE细胞中NFAT1基因的表达来初步探讨HCV C的可能致瘤机制。

1    材料与方法

1.1 材 料

人胆管癌细胞株RBE细胞购自中国科学院上海细胞库，RPMI1640培养基及胰蛋白酶购自GIBCO公司；NFAT1鼠抗人单克隆抗体购自Abcam公司；RNA提取试剂Trizol、脂质体（lipofectamine^TM 2000）均购自美国Invitrogen公司；RT-PCR试剂盒购自TaKaRa公司。pEGFP-N₃载体购自莱德尔公司，无内毒素质粒提取试剂盒购自广州津美公司；96孔板购自美国corning公司;4-甲偶氮唑蓝( MTT ) 购自碧云天生物技术研究所;二甲基亚砜购自美国Sigma公司。

1.2  细胞培养

RBE细胞培养于含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养基中，置于37℃、体积分数5% CO₂和相对湿度95%的恒温培养箱中培养。1～2 d 换液，当细胞生长接近90%融合时，用质量浓度0.25%胰酶消化细胞，以1:2或1:3比例传代。

1.3  pEGFP-N₃-HCV C真核表达质粒构建

  将pEGFP-N₃载体和HCVc PCR片段分别用Hind Ⅲ和XhoⅠ双酶切后，凝胶回收纯化产物。将两个片段用T4 DNA连接酶于16℃连接过夜，取5μl转化到大肠杆菌感受态DH5α中，37℃培养过夜。挑取单克隆菌落，接种于含卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡过夜。用无内毒素质粒提取试剂盒提取质粒DNA，再鉴定外源基因的插入，送菌液于公司进行测序分析。

1.4瞬时转染

将3～4 x 10⁵个RBE细胞重悬于2ml含100ml／L胎牛血清的RPMI1640培养基中，转种于6孔培养板中；37℃、5%CO₂培养箱中培养24h，使细胞达90％～95％融合，实验分组：A组为处理组，共转染质粒pEGFP-N₃ 和HCV C；B组仅转染空质粒，C组为空白组，仅以无血清培养基培养。按Lipofectamine™2000转染试剂盒说明书，进行细胞转染，24～48 h后收集细胞进行转染后检测。每组实验重复3次。

1.5 细胞转染荧光检测及转染后细胞形态学特点

    转染48h后，倒置相差荧光显微镜下观察并拍照。

1．6流式细胞仪分析细胞周期

将浓度为3×10⁵个／mL的RBE 细胞接种于6 孔板内，培养箱培养24 h 后，按说明书进行质粒的转染。转染处理后24h，收集细胞，在PBS 中吹匀为单细胞悬液，750mL／L乙醇4℃固定过夜， 固定后细胞以PBS 洗涤2次。在避光条件下加入PI染液，室温孵育30 min，用流式细胞仪分析样品。

1.7 MTT法检测HCVc对细胞增殖的影响

   取处于对数期生长的RBE细胞，接种细胞密度为1×10⁶/mL，接种于96孔板，培养24小时，约70%-80%融合后，转染目的质粒，分为HCVc质粒组，空质粒转染组，空白对照组，置于培养箱（37℃，5%CO₂）中，培养24h、48h、72h、96h后，移出培养液，换入无血清RPMI1640培养液200ul/孔，并每孔加入MTT(5mg/ml)10ul。继续培养4h,弃去原培养液，每孔中加入DMSO100ul，置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解并于酶联免疫检测仪490nm 波长处检测吸光度A值，以A值反映活细胞水平，实验重复3次。

1.8 SYBR Green实时定量PCR 检测基因NFAT1的mRNA表达

  1.8.1  pEGFP-N₃-HCV C质粒瞬时转染RBE细胞24h后，Trizol法提取各组细胞的总RNA,用紫外分光光度计检测提取RNA的浓度及纯度，并确定RNA的纯度在1.8～2.0之间。按RT试剂盒操作说明书合cDNA。由TaKaRa公司合成NAT1及β-actin引物，NFAT1(136 bp)上游引物：5′-ACCAGTACCCGCACTTGCAC-3′,下游引物：5′-CGCTTCTCGCTCTCGTTCAG-3′。β-actin (186 bp)上游引物：5′-

TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游引物：5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。PCR反应条件为：95℃ 30 s， 94℃ 15 s 及60℃ 30 s， 共40个循环，95℃ 15 s，60℃ 15 s，95℃ 15 s。从60℃到95℃每上升0．5℃ 取一次荧光值，最后生成融解曲线,通过融解曲线确定反应产物的单一性。所有标本均重复检测3次,计算出Ct 值，各基因mRNA 相对表达量采用2^-△△Ct法进行计算分析，并用图像定量分析软件进行数据处理。

1.8.2　2^-△△Ct法对NFAT1基因进行相对定量　

通过相对定量(relative quantity ,RQ)法(RQ =2^-△△Ct)计算目的基因相对于参照因子(calibrator)的倍数来比较基因的表达差异。管家基因GAPDH 作为内参基因,每一个样本的△Ct= Ct(target gene)2 Ct (β-actin) ,而△△Ct=△Ct(target gene)-△Ct(calibrator)。

1.9  Western blot测定NFAT1蛋白的表达

pEGFP-N₃-HCV C质粒瞬时转染RBE细胞48h后，按说明书提取总蛋白。调整样品蛋白浓度使其相同，取样品经8％SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转印至硝酸纤维素膜（PVDF）膜上。PVDF膜以50g／L脱脂奶粉封闭1～3h，加入NFAT1鼠抗人单克隆一抗（1∶500）于4℃孵育过夜。经TBST漂洗3次后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗（1∶5000），室温孵育1h,TBST漂洗3次，ECL化学发光法试剂盒显影、曝光。扫描图像并保存，经BioRad公司的图形分析软件Quantity One对图片进行分析并测定灰度值。取NFAT1/GAPDH的灰度值之比作为蛋白的相对表达量。

2.0 统计学方法

每组实验重复3次，数据以均数±标准差（χ±s）表示，应用统计软件包SPSS13．0进行统计学分析，对数据采用两独立样本的t检验，以P＜0．05为差异有统计学意义。

2    结  果

2.1 细胞转染荧光检测　

    细胞转染48h后均可见较多特异性GFP绿色荧光的表达，表明我们的转染相对成功。

2.2 pEGFP-N₃-HCV C基因重组鉴定　将重组真核表达质粒经Hind Ⅲ和EcoRⅠ双酶切以及重组质粒DNA 序列送经公司测定证实重组真核表达质粒中包含目的片段HCV C,同时Western blot结果证实目的条带约为45bp,证实含有目的基因HCV C的重组真核表达质粒构建成功(图三)。      

2.3  HCV C基因对NFAT1 mRNA水平表达的影响

     经Real Time PCR分析发现，转染HCV C基因RBE组的NFAT1／β-actin 光密度比值是2.03 ± 0．32,空质粒组为1.12±0.28，空白组为1.00 ± 0．11,与空白组比较，转染HCV C基因组细胞NFAT1表达量显著升高，差异有统计学意义（P<0．05）。

2.4  HCV C基因对NFAT1蛋白水平表达的影响

     Western blot 结果显示pEGFP-N₃-HCVc质粒瞬时转染细胞经48 h后，空白组、转染空质粒组、转染质粒组的NFAT1／GAPDH灰度值比值分别是0.68±0.26、0．79 ± 0．02、1.75 ± 0．01，与空白组和空质粒组比较，转染HCV C组NFAT1蛋白表达量显著升高，差异有统计学意义（P＜0．05）。（见图五）

2．5 HCV C对RBE细胞的细胞周期及细胞增殖的影响

转染HCV C后，与空质粒组细胞G0/G1期（74.34±0.6%）相比，转染质粒组细胞百分比降低，为（69.16±1.2%），同时发现S期及G2/M期细胞数相应升高。同时通过图7可发现转染HCV C质粒组、控制立足、空白组RBE细胞生长曲线比较，转染HCV C基因组细胞生长速度明显增快（P＜0．05）

3  讨  论

    HCV(hepatitis C virus)是导致丙型病毒性肝炎的病原体，亦是肝硬化(LC)和肝细胞癌(HCC)的主要病因^[6]。前期研究证明丙型肝炎病毒的慢性持续感染与胆管癌发病密切相关^[7],[8]。但它们之间的确切致病机制仍未完全阐明。HCV可被蛋白酶裂解成3～4个结构蛋白和至少6个非结构蛋白,其中核心蛋白是一个多功能蛋白，能够影响多种细胞信号转导途径，激活多种病毒及细胞启动子，参与细胞凋亡、转录调控、转化及免疫逃逸，从而在病毒的致病、致癌机制中发挥着重要的作用。如在稳定表达HCV C蛋白的HepG2细胞系中，C蛋白上调c-Myc而促进细胞周期进程^[9]；HCV C蛋白还可通过与CDK活化激酶(CDK activating kinase，CAK)相互作用而抑制了E2F介导的转录、CDK4和CDK2的活性等环节，从而抑制细胞从G1期到S期的进程，导致细胞周期进程发生阻滞^[10]。

活化T细胞核因子（nuclear factor of activated T cell, NFAT）是细胞内多信号转导通路的基础分子，可调节IL-2、IL- 3、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)基因和环氧化酶-2(COX-2)等多种细胞因子的表达水平, 影响生物体的基础免疫和抗肿瘤免疫状态,促进肿瘤细胞生长和肿瘤血管的生成,是肿瘤侵袭和转移的重要影响因素^[11],[12]。NFAT蛋白家族分为5大类,包括NFAT1 (NFATc2或NFATp)、NFAT2（NFAT c1或NFATc)、NFAT3（NFATc4)、NFAT4(NFATx或NFATc3) 和NFAT5(TonEBP或OREBP )^[13]。

在NFAT蛋白中,NFAT1~4亚型有NFAT同源区(NFAT-homology region, NHR)和Rel同源区(Rel-homology region, RHR)两个非常保守的区域。NHR区域能与钙调节蛋白磷酸酶结合并由其激活。在静止细胞中,NFAT蛋白被磷酸化存在于细胞浆中,对DNA具有低亲和力。Ca²⁺/CaN是NFAT活化的最主要途径,当各种途径引起的细胞内游离Ca^{2 +}浓度增高, CaN的活性随之增强并与NFAT的NHR位点结合,引起NFAT脱磷酸、向细胞核内易位以及与DNA的结合力增强, 进而调节多种细胞因子的转录表达水平^[14]。Bcrgqvist等用Jurkat细胞来研究时发现核心蛋白促进了IL-2启动子的转录激活，其活化程度依赖于NFAT的活化。通过后来更进一步的实验发现，核心蛋白是通过诱导Ca²⁺的振动来调节钙信号的功效，从而促进NFAT的活化，进而使IL-2基因转录被激活^[15]。

为明确胆管癌中HCV C对转录因子NFAT1的调控作用，我们通过转染HCV C基因至肝内胆管癌RBE细胞，结果显示转染后细胞中NFAT1 mRNA和蛋白表达水平均较转染空质粒组及空白组显著增高，而转染空质粒组及空白组之间无明显差别；同时结果显示细胞周期中G1期细胞减少，G2/M及S期细胞增多，提示HCV C可促进RBE细胞的细胞周期进程加快，细胞增殖能力增加。综上所述，HCV C可能通过Ca²⁺/CaN/NFAT信号转导途径上调NFAT1的表达和生物学活性，同时影响胆管癌细胞的恶性生物学行为。

本研究证实, HCV C蛋白可显著激活胆管癌中的Ca²⁺/CaN/NFAT信号通路,因此将来可把NFAT1作为药物或基因治疗的一个靶标,通过阻断引起NFAT1激活的信号转导途径或通过抑制NFAT1与靶DNA的结合活性而达到治疗胆管癌的目的。因此该研究或为寻找胆管癌有效的治疗手段开辟了新的途径。

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