大肠埃希菌临床菌株生物被膜形成的分析-医学临床论文

Quantificative analysis for Biofilm-Formation of Escherichia coli Isolates

ABSTRACT: Objective Escherichia coli clinical isolateswere analyzed quantitatively for their biofilm-formation. Methods A method of microtiterplate culture-crystal violet stain was established for the quantificative analysis of biofilm-formation for the isolates. And 49 Escherichia coli isolates were testeded by the method for their biofilm-formation. Results Among 49 Escherichia coli isolates examined, 18 formed biofilm of middle quantity, 24 more quantity biofilm, 7 small quantity. Conclusion Most of Escherichia coli clinical isolates formed biofilm of middle and more-quantity.

KEY WORDS: Escherichia coli；bacterial biofilm；quantificative analysis

摘要：许多病原性细菌在感染机体内可以生物被膜状态存在，生物被膜的形成是某些细菌性疾病难以治愈或反复发作的主要原因之一[4,5]。大肠埃希菌（Escherichia coli）是医院常见条件致病菌之一，是典型的生物被膜菌[1-5]。本研究通过建立大肠埃希菌生物被膜的检测方法，分析大肠埃希菌临床菌株生物被膜的形成。

关键词：大肠埃希菌；细菌生物被膜；定量分析

中图分类号：R387.99  文献标识码：A

材料和方法

一、试验菌株 

49株大肠埃希菌，分离自2008年1月至2月间江西省九江市第一人民医院患者的各类标本（痰液、尿液、创口分泌物、血液），经美国BD PhoenixTM-100全自动细菌鉴定/药敏系统，生物被膜阳性铜绿假单胞菌PAO1。

二、大肠埃希菌生物被膜检测方法的建立

    参考文献方法[6]建立大肠埃希菌生物被膜检测方法。对在49株大肠埃希菌临床菌株中随机选取的6株菌、生物被膜阳性铜绿假单胞菌PAO1进行生物被膜培养。将上述7株菌在Luria-Bertani（LB）液体培养基中37℃过夜培养，用细菌标准比浊管调节菌液浓度为1×109CFU/mL；用96孔平底组织培养板培养生物被膜，每孔加入10μL菌液和200μL LB培养基培养液（1:50稀释），空白对照孔只加培养液，每株菌作6个复孔，37℃静止培养。选取72h生物被膜培养物进行定量分析。每个菌取3个复孔，加入150μL 0.25g/L结晶紫染液，室温下染色15min；用生理盐水冲洗后晾干；每孔加入95％乙醇150μL，室温脱色10min；用紫外可见分光光度计检测每孔脱色液在570nm光波的吸光度(A570nm)。每个菌的A570nm等于其3个复孔的A570nm平均值减去3个空白对照孔A570nm的平均值。同时，对每个菌的另3个复孔进行细菌计数，即每孔加入150μL 0.25g/L结晶紫染液，室温下染色15min；再用自制的细胞刮刀刮取培养孔底部及侧壁的生物被膜，收集被膜菌液，在漩涡振荡器上将菌体充分打散；最后用血球计数板计数染色菌体的数量；每个培养孔生物被膜中细菌的数量取3个复孔的平均值。

应用SPSS 11.5统计软件对各大肠埃希菌生物被膜结晶紫染色的乙醇脱色液A570nm值与其相应生物被膜中细菌的数量进行相关性分析，以判断能否以乙醇脱色液A570nm值辅助衡量比较生物被膜中细菌的数量。生物被膜中细菌的数量越多，则表明生物被膜形成的量越多。

三、大肠埃希菌临床菌株生物被膜形成的半定量分析

  按上述方法，检测48株大肠埃希菌临床分离株生物被膜的形成，即生物被膜培养物乙醇脱色液的A570nm。生物被膜阳性菌铜绿假单胞菌PAO1可形成中等厚度、或量的生物被膜，本试验中该菌的A570nm为0.456，同时参照文献方法[6，7]，将所测各菌株生物被膜形成的量分为三个等级：A570nm ≤ 0.3 者为生物被膜形成的量少，以“＋”表示；0.3 ＜A570nm  ≤ 1.0者为生物被膜形成的量中等，以“＋＋”表示；1.0 ＜A570nm者为生物被膜形成的较大，以“＋＋＋”表示。按上述标准对各菌株生物被膜形成的量进行比较分析。

结  果

一、大肠埃希菌生物被膜形成的定量分析方法的建立 

随机选取的6株大肠埃希菌临床分离株和生物被膜阳性对照菌进行生物被膜培养，分别得到生物被膜结晶紫染液之乙醇脱色液A570nm，以及生物被膜中细菌的数量。经SPSS11.5统计软件分析，生物被膜中细菌数的对数与其A570nm成正相关（r＝0.945）(见图1)。结果表明以大肠埃希菌生物被膜结晶紫染液的乙醇脱色液A570nm 可衡量比较生物被膜中细菌的相对数量。

图1 大肠埃希菌临床分离株生物被膜中细菌数的对数与A570nm的相关性分析.

（A570nm：细菌生物被膜乙醇脱色液在570nm光波的吸光度；

Log10CFU：细菌生物被膜中细菌数的对数）

二、大肠埃希菌临床菌株生物被膜的分析

在所检测的49株大肠埃希菌临床菌株中，其中24株菌（49.0％）形成生物被膜的量较大（＋＋），18株（36.7％）形成生物被膜的量为中等（＋＋＋），7株菌(14.3％)形成生物被膜的量少（＋）。                                                                                  

讨论

细菌在形成生物被膜的过程中，伴随着某些性状的变化，这些变化有些与菌体抗性的提高有关，如大量胞外多糖的产生，减低了抗生素向被膜内部的渗透；细菌在生物被膜状态下，很多物质（特别是大分子物质）难以进行正常的物质交换作用，在被膜内部的细菌往往是处于一种低代谢、低能耗和低活性的状态，导致菌体对抗生素的敏感性减低；被膜内部的菌株发生突变形成耐药株等，这些变化都有利于提高菌体对抗生素的耐受性，研究报道细菌在生物被膜状态的耐药性比游离的单个菌体显著提高[1-4]。此外生物被膜还可向周围环境缓慢释放浮游菌，成为潜在的感染源。故细菌生物被膜是细菌感染难以治愈或感染反复发作的重要原因。细菌形成生物被膜的厚度和体积大小不一，被膜的厚度和体积越大，往往抗性也越强。传统的药敏试验测得的最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentraton，MIC）是针对单个存在的细菌。据报道用传统的药物敏感试验测得的某菌株对抗生素的MIC和生物被膜敏感实验所测得细菌生物被膜的最小抑菌浓度（Biofilm inhibitory concentration，BIC)是不相同的，两类药敏试验所选出的敏感药物的种类也存在很大差别[8]。因此如不考虑细菌在感染机体形成生物被膜的特性，只依据传统方法测得的MIC指导临床抗生素的使用，对生物被膜菌感染的治疗很难达到满意的效果，因此临床在使用抗生素治疗生物被膜菌感染时应考虑细菌形成生物被膜的性。

本文采用平板培养法建立大肠埃希菌生物被膜的体外模型，并借鉴文献报道的方法[6，7]建立了大肠埃希菌平板培养－结晶紫染色的生物被膜检测方法，该法可分析大肠埃希菌临床菌株生物被膜的形成，具有一定的临床应用价值。本研究对49株大肠埃希菌临床菌株生物被膜的形成进行分析中，结果表明绝大多数大肠埃希菌临床菌株能形成较厚的生物被膜。本研究结果提示在临床治疗大肠埃希菌相关感染时，若遇到依据传统药敏实验结果进行抗生素治疗效果不佳的情况，或大肠埃希菌感染久治不愈时，应考虑对致病菌株进行生物被膜的形成进行检测，或做细菌生物被膜药物敏感试验，选择细菌生物被膜敏感的抗生素，以提高大肠埃希菌感染的临床治疗效果。

参考文献:

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